徐 静，王 星，陈大虎*

（江苏师范大学 生命科学学院，江苏 徐州 221116）

神经纤维瘤病Ⅱ型（neurofibromatosistype 2，NF2）是重要的抑癌基因，其编码的Merlin蛋白表达水平的变化与肿瘤的发生密切相关。抑癌蛋白Merlin是一种细胞结构蛋白，在细胞膜和细胞骨架之间起着连接的作用[1]。NF2基因缺失、突变或被抑制将造成Merlin蛋白缺失与失活，引起细胞失控性增殖，最终导致肿瘤的形成[2-3]。Merlin蛋白可以调控细胞增殖、运动[4]，与生长发育、早期胚胎发育[5]存在很大关联性[6]，对抑制肿瘤细胞迁移和侵袭起到重要作用[7-8]。因此，NF2基因介导的肿瘤发生及Merlin蛋白的功能的研究具有十分重要的意义。Merlin蛋白的构象和活性受翻译后加工修饰，研究表明，Merlin蛋白可以被泛素化[9]，从而促进底物蛋白的降解过程。但对其去泛素化的研究却比较少。去泛素化是泛素化的一个相反过程，通过去除单泛素或多聚泛素分子可以稳定底物蛋白水平[10]，与细胞增殖、细胞凋亡等生命活动密切相关[11]。在体内，蛋白质泛素化与去泛素化形成动态平衡，调节机体的蛋白质功能、代谢，影响细胞周期、细胞分化、免疫等[12]。

泛素特异性蛋白酶13（ubiquitin-specific peptidase 13，USP13）是去泛素化酶（deubiquitinases，DUBs）中泛素特异性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases，USPs）家族中的一员，也是半胱氨酸依赖蛋白酶超家族成员之一[13]。去泛素化酶USP13通过裂解赖氨酸48（lysine 48，K48）连接的多聚泛素链，使泛素分子从底物蛋白中分离，从而逆转因泛素化引起的底物蛋白的降解[14-15]。已有研究表明，USP13可以通过直接与抑癌蛋白第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白（phosphateand tensionhomology deleted onchromsometen，PTEN）结合并使其去泛素化[16]来稳定PTEN的蛋白水平，其通过调节PTEN抑制了肿瘤形成和糖酵解过程[17-18]。Merlin蛋白作为一个已知的抑癌蛋白，而且是第一个被发现具有肿瘤抑制作用的蛋白质[19]，为研究Merlin蛋白是否与去泛素化酶USP13之间存在类似的关系并且受USP13的调节。本研究通过构建MYC-tagged Merlin与FLAG-tagged USP13表达载体，采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）和蛋白质印迹法（western blot，WB）等方法初步研究去泛素化酶USP13和抑癌蛋白Merlin之间的关系。为进一步研究去泛素化酶USP13对抑癌蛋白Merlin的调节作用奠定了基础，为肿瘤的发生、发展提供了相关线索。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 细胞与质粒

293T细胞：江苏师范大学生命科学学院肿瘤分子生物学实验室；Trans5α感受态细胞：北京全式金生物技术有限公司；质粒pCMV-3Tag-6（FLAGtag）、pCMV-3Tag-7（MYC tag）：美国安捷伦科技有限公司。

1.1.2 培养基

LB液体培养基、LB固体培养基：生工生物工程（上海）股份有限公司；杜尔伯科改良伊格尔培养基（dulbecco's modified eaglemedium，DMEM）：美国Hyclone公司。

1.1.3 试剂

酶切buffer、BamHⅠ（5000U/mL）、EcoRⅤ（2000U/mL）、XhoⅠ（2 500 U/mL）、HindⅢ（5 000 U/mL）限制性核酸内切酶、T4连接酶（10000U/mL）、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）纯化试剂盒、Trypsin胰蛋白酶、Anti-c-MYCMouse抗体、Anti-FLAG Rabbit抗体、Anti-Rabbit IgG HRP、Anti-Mouse IgG HRP、胎牛血清：北京全式金生物技术有限公司；三磷酸脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTPs）：北京索莱宝科技有限公司；1 kbp蛋白Marker：宝日医生物技术（北京）有限公司；氨苄青霉素、Goldview染料：南京金斯瑞生物科技有限公司；protein G agerose珠子、Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂：美国Thermo Fisher Scientific公司；荧光显影液：美国BIO-RAD公司；Q5高保真DNA聚合酶（5 000 U/mL）：美国NEB公司。

1.2 仪器与设备

DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；MB-102振荡型恒温金属浴：杭州博日科技有限公司；Centrifuge 5424 R高速冷冻离心机、Mastercycler nexus聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）仪：艾本德（中国）有限公司；SW-CJ-1FB单人超净工作台：苏州净化设备有限公司；OPTIMAX型X射线胶片洗片机：德国布鲁泰克有限公司；TL-4荧光倒置显微镜：中国OLYMPUS公司；Thermo 371细胞培养箱、Thermo 1389型超净工作台：美国Thermo Fisher Scientific公司；Gel Doc XR凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；LRH-70生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NF2基因和USP13基因的调取

以Trizol法提取的293T细胞总RNA为模板，采用反转录试剂盒反转录得到cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增NF2基因、USP13基因的全长。NF2基因的上游引物为5′-ATTAGGATCCATGGCCGGGGCCATCGCTTCC-3′，下游引物为5′-ATGCGATATCAATGCAGATAGGTCTTCTGCCT-3′。USP13基因的上游引物为5′-ATTAAAGCTTATGCAGCGCCGGGGCGCCCTGTT-3′，下游引物为5′-TAGCCTCGAGGCTTGGTATCCTGCGGTAAAA-3′。PCR扩增体系：上游引物、下游引物（10μmol/L）各1.25μL，模板1μL，5×Q5buffer 5μL，Q5高保真DNA聚合酶0.5μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5μL；双蒸水（ddH2O）15.5μL。PCR扩增条件：98℃预变性30 s；98℃变性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸1 min 30 s，39个循环；72℃再延伸2 min。采用1%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测。

1.3.2 表达载体的构建及鉴定

NF2基因表达载体NF2/pCMV-3Tag-7的构建及鉴定：NF2基因的PCR扩增产物与质粒pCMV-3Tag-7分别经核酸内切酶（BamHⅠ、EcoRⅤ）双酶切、纯化获得带有粘性末端的NF2基因与载体pCMV-3Tag-7，NF2基因与载体pCMV-3Tag-7在16℃条件下过夜连接得到表达载体NF2/pCMV-3Tag-7后转化至Trans5a感受态细胞。感受态细胞涂布于含50mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，只有当重组质粒或者原始质粒成功转化到感受态细胞，感受态细胞才能在含氨苄青霉素的LB固体培养基上形成克隆。然后对阳性克隆进行酶切鉴定并送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

USP13基因表达载体USP13/pCMV-3Tag-6的构建及鉴定：方法同NF2基因表达载体的构建及鉴定，所用载体为pCMV-3Tag-6，所用限制性核酸内切酶为XhoⅠ、HindⅢ。1.3.3 NF2基因、USP13基因表达载体的蛋白表达

转染：利用阳离子聚合物基因转染技术[20]，转染试剂为聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI），将表达载体NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6分别转染到293T细胞中。具体操作：用500μL无血清培养基DMEM与PEI、表达载体混合，PEI与表达载体的比例为3μL∶1μg，室温放置30 min。同时，用无血清培养基DMEM替换293T细胞培养皿中的完全培养基。将混合液均匀滴入293T细胞培养皿中，37℃培养5 h后用完全培养基替换，继续培养48～72 h。

蛋白提取：用4℃预冷的磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer saline，PBS）洗涤细胞，用细胞刮刀刮下细胞，混合液经2 500 r/min离心2 min，弃上清，收集细胞。加入60～100μL RIPA裂解液（每15 mL加一片蛋白酶抑制剂）裂解细胞，冰上孵育15～30 min，4℃离心10 000～14 000 r/min，取上清，获得细胞总蛋白。其中RIPA裂解液：10 mmol/L Tris（pH 7.4）、150 mmol/L NaCl、1%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、1%乙基苯基聚乙二醇（nonidet p 40，NP-40）。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：取60μL细胞蛋白提取液，加入12μL 5×蛋白上样缓冲液，100℃变性8 min后进行SDS-PAGE电泳，蛋白上样量为10～20μL。

WB：转聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride，PVDF）的条件是250 mA、2h。用5%的脱脂牛奶对膜进行封闭2h以上。分别加Anti-FLAGRabbit抗体（检测USP13）或Anti-c-MYCMouse抗体（检测Merlin）4℃过夜，抗体与脱脂牛奶体积比为1μL∶3 000μL，加辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗，二抗与脱脂牛奶体积为1μL∶5 000μL。经洗膜、显影液化学发光，最后用OPTIMAX X光洗片机对膜进行曝光洗片，并记录结果。其中5%的脱脂牛奶由0.15 mol/L磷酸盐缓冲液-0.4%吐温20（phosphate buffer solution-tween-20，PBS-T）配制。

1.3.4 免疫共沉淀验证Merlin与USP13相互作用

按照方法1.3.3，将表达载体NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6共转染到293T细胞中，培养48～72 h后收取细胞，用100～200μL RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）裂解细胞，获得细胞蛋白，获得的蛋白提取液一部分进行Input试验，检测共转染的重组质粒表达情况。Input表达良好后，进行Co-IP。Co-IP条件：取5μL对应抗体于蛋白提取液中，在旋转仪上4℃旋转1～2h，加入30～50μLprotein Gagerose珠子，4℃旋转过夜，用IPBuffer洗珠子3～5次，100℃煮样品6～8min。然后进行WB检测，并对结果进行记录及分析。

2 结果与分析

2.1 NF2基因和USP13基因的调取结果

NF2基因与USP13基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

图1 NF2基因（a）和USP13基因（b）的PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products of NF2 gene(a)and USP13 gene(b)

由图1a可知，碱基长度在1 650～2 000 bp范围内有明显的目的条带，NF2基因的片段约为1 700 bp。由图1b可知，碱基长度在2 000～3 000 bp范围内有明显的目的条带，USP13基因的片段约为2 500 bp，表明NF2基因和USP13基因调取成功。

2.2 表达载体的构建及鉴定结果

从含氨苄青霉素的LB固体培养基上挑取阳性克隆子进行酶切鉴定，表达载体NF2/pCMV-3Tag-7用BamHⅠ、EcoRⅤ进行双酶切，USP13/pCMV-3Tag-6用XhoⅠ、HindⅢ进行双酶切。结果见图2。

图2 表达载体NF2/pCMV-3Tag-7（a）与USP13/pCMV-3Tag-6（b）的鉴定Fig.2 Identification of expression vectors NF2/pCMV-3Tag-7(a)and USP13/pCMV-3Tag-6(b)

由图2可知，表达载体NF2/pCMV-3Tag-7及USP13/pCMV-3Tag-6经双酶切后，载体和目的片段分开，与Marker对比，目的片段大小正确，表明两个表达载体构建完成。

2.3 蛋白表达的检测

Merlin蛋白表达的检测：将NF2/pCMV-3Tag-7表达载体转染至293T细胞，培养48～72 h后裂解细胞收集蛋白，采用鼠抗MYC进行WB检测，结果见图3。

图3 Merlin蛋白表达的WB检测结果Fig.3 Determination results of expression of the Merlin protein by WB

由图3可知，从内参蛋白β-Actin可以看出，两个样品上样量基本相同。转入表达载体NF2/pCMV-3Tag-7的细胞表达的蛋白在相应的分子质量大小处有明显的目的条带，而转入载体pCMV-3Tag-7的细胞表达的蛋白无目的条带，表明构建的表达载体在293T细胞中有效表达Merlin蛋白。

去泛素化酶USP13表达的检测：将USP13/pCMV-3Tag-6表达载体转染至293T细胞，培养48～72 h后裂解细胞收集蛋白，用兔抗FLAG进行WB检测，结果见图4。

图4 去泛素化酶USP13蛋白表达的WB检测结果Fig.4 Determination results of expression of the deubiquitinase USP13 protein by WB

由图4可知，转入表达载体USP13/pCMV-3Tag-6的细胞表达的蛋白在相应的分子质量大小处有明显的条带，而转入载体pCMV-3Tag-6的细胞表达的蛋白在对应位置无条带，表明构建的表达载体在293T细胞中有效表达去泛素化酶USP13。与内参蛋白相比较，去泛素化酶USP13在293T细胞中的表达量相对较高。

2.4 Merlin蛋白与USP13蛋白的相互作用

Co-IP是一种检测蛋白质之间相互作用的有效方法。目前，免疫共沉淀广泛应用于研究生理条件下蛋白质间的相互作用。为检测Merlin蛋白与去泛素化酶USP13是否存在相互作用的关系。将表达载体NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6共转染到293T细胞中，收集蛋白后，用鼠抗MYC对Merlin蛋白进行Co-IP实验，用兔抗FLAG对Merlin蛋白做WB检测，结果见图5。

由图5可知，鼠抗MYC将MYC-Merlin蛋白沉淀下来的同时，经WB可检测到FLAG-USP13蛋白，而加入无关抗体IgG的体系中未检测到FLAG-USP13蛋白，说明Merlin蛋白与去泛素化酶USP13在细胞内可以相互作用。

为了进一步探讨及验证Merlin蛋白与去泛素化酶USP13相互作用的特异性与真实性，因此，采用用兔抗FLAG对去泛素化酶USP13做Co-IP实验，用鼠抗MYC对Merlin蛋白进行WB检测，结果见图6。

从图6可以看出，三组样品的Merlin蛋白与去泛素化酶USP13均表达良好，表明这两个蛋白在293T细胞中共表达。同样，兔抗FLAG对去泛素化酶USP13做Co-IP时，WB检测到MYC-Merlin蛋白的表达，IgG作为无关抗体时未检测到MYC-Merlin蛋白，说明Merlin蛋白与去泛素化酶USP13之间确实存在特异地相互作用关系。

图5 Merlin蛋白与去泛素化酶USP13的免疫共沉淀正方向结果Fig.5 Positive results of Co-IP of the Merlin protein and the deubiquitinase USP13

图6 Merlin蛋白与去泛素化酶USP13的免疫共沉淀反方向结果Fig.6 Negative results of Co-IP of the Merlin protein and the deubiquitinase USP13

3 结论

本研究从293T细胞中成功调取NF2及USP13基因，构建表达载体NF2/pCMV-3Tag-7和USP13/pCMV-3Tag-6后共同转染至293T细胞中进行表达，证明Merlin蛋白与去泛素化酶USP13之间具有相互作用。去泛素化酶USP13是否对Merlin蛋白在细胞中的表达水平有所影响有待后期的进一步研究。后期还需确定去泛素化酶USP13与Merlin蛋白的调节关系，以及这两个蛋白相互作用的功能域，并了解其对肿瘤细胞的功能性影响。这两种基因与人类肿瘤的发生发展都密切相关，此研究为进一步研究Merlin蛋白与去泛素化酶USP13之间的调节关系及其在肿瘤中的有关作用提供了参考，对于揭示抑癌蛋白Merlin的功能具有生物学意义。