喻大昭 曾凡松

摘要

基因对基因假说阐明了病原菌无毒基因（avirulence gene， Avr gene）与寄主植物抗性基因（resistance gene， R gene）相互识别和互作的关系。禾谷类白粉菌无毒基因产物作为重要的激发子，能够与其寄主R基因产物发生特异性互作，诱导植物细胞防卫反应。为了更加深入地了解这些无毒基因的作用，作者总结了最近关于AVRa1、AVRa10、AVRa13、AVRk1、AvrPm2和AvrPm3a2/f2等已克隆无毒基因的研究进展，讨论了它们作为效应蛋白（effector）或激发子的双重功能，在毒性菌株中的变异规律，与其对应R基因之间的互作模型，以及与转座子等重复序列之间的关联等。本文还对无毒基因研究方法的改进和未来的研究方向提出了建议。

关键词

无毒基因; 禾谷类白粉菌

中图分类号：

S 435.12

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018290

Avirulence genes in cereal powdery mildews

YU Dazhao， ZENG Fansong

（Key Laboratory for Integrated Management of Crop Pests in Central China， Ministry of Agriculture of

China， Hubei Key Laboratory for Control of Crop Diseases， Insect Pests and Weeds， Institute of

Plant Protection and Soil Science， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract

The gene-for-gene hypothesis elucidates the recognition and interaction between avirulence gene （Avr gene） of pathogens and resistance gene （R gene） of hosts. Avr protein of the cereal powdery mildew pathogens， as important elicitors inducing defense reaction in plant cells， can interact specifically with the cognate R proteins of their hosts. To further understand the roles played by these Avr genes， we summarized the recent progress in Avr genes like AVRa1， AVRa10， AVRa13， AVRk1， AvrPm2 and AvrPm3a2/f2. The dual function of these avirulence genes acting as effectors or elicitors， their variation in virulent isolates， the interaction models between them and their cognate R genes， as well as their association with repetitive sequences such as transposons were discussed. Better methodologies used for Avr gene studies and future research focus were also suggested.

Key words

avirulence gene; cereal powdery mildews

在符合基因对基因学说的植物病害中，植物的抗性基因（resistance gene， R gene）与病原菌的无毒基因（avirulence gene， Avr gene）相互识别，激发植物抗病性[1-2]。大多数R基因编码保守的NLR（nucleotide-binding， leucine-rich repeat receptor， NLR）受体类蛋白[3]。R蛋白直接或间接地与其对应的无毒基因产物识别，激发植物细胞过敏性坏死反应（hypersensitive reaction， HR）[4]。一方面，在R蛋白施加的选择压力作用下，病原菌通过效应子（effector）的进化来逃避R蛋白的识别，从而阻止寄主产生防卫反应[5]。另一方面，由于R蛋白識别的特异性主要是受其富含亮氨酸重复（leucine-rich repeat，LRR）结构域控制的，植物可以通过LRR结构域中少数几个氨基酸的突变对抗性进行修饰[6]。因此，植物R蛋白与病原菌Avr蛋白之间存在着协同进化关系。由禾布氏白粉菌Blumeria graminis引起的禾谷类白粉病是大麦和小麦等作物上的重要病害，且白粉菌与其寄主之间存在基因对基因关系[7-8]。白粉菌无毒基因的克隆和功能分析不仅有助于从分子层面上理解病原菌毒性变异和与寄主协同进化的机制，而且有助于建立病原菌致病型快速检测技术，监测病原菌的毒性变异，以便合理有效地利用抗性资源。因此，作者对禾谷类白粉菌无毒基因的来源、克隆、特征、功能、变异及其研究方法等方面进行了归纳和总结。

1 禾谷类白粉菌效应子基因

病原菌通过向植物细胞中注入一类被称为效应子的分泌性毒性因子来抑制植物先天免疫反应[9]。在这些效应子基因中，一些能够被植物特定的R蛋白识别的基因被称为无毒基因[10]。因此，效应子基因的鉴定可以为无毒基因的克隆提供候选基因。大麦白粉菌B.graminis f.sp. hordei（Bgh）基因组分析结果表明，Bgh含有491個N端带有信号肽的候选分泌性效应子蛋白（candidate secreted effector protein， CSEP）[11-12]。在小麦白粉菌B.graminis f.sp.tritici（Bgt）的基因组中鉴定出了437个CSEP编码基因和165个不含有信号肽的效应子基因。

而且，大部分Bgh效应子基因（79%）和Bgt效应子基因（99%）在吸器中表达，暗示它们可能在禾谷类白粉菌与寄主互作和致病过程中发挥作用[11， 13]。序列特征分析表明，白粉菌的这些效应子基因通常编码比较小的蛋白，在序列上与其他真菌的基因没有同源性，它们彼此具有明显的序列分化[12]，说明它们可能靶向寄主细胞中不同的蛋白，执行不同的功能。但是，大多数CSEP的N端信号肽下游含有一个保守的YFWxC基序[14]。该基序的保守性提示它们可能与卵菌效应子保守RxLR基序类似，在效应子蛋白分泌进入植物细胞过程中起作用[15]。另外，与其他非CSEP基因相比，CSEP基因具有更高的氨基酸替换dN/dS比值，这说明效应子基因存在明显的多样化选择趋势，在与寄主协同进化过程中具有更快的进化速率[13， 16-17]。

2 禾谷类白粉菌无毒基因的特征和功能

到目前为止，在禾谷类白粉菌无毒基因中，只有少数几个被克隆。从20世纪90年代开始，一些植病工作者对Bgh的无毒基因进行了遗传分析。对菌株杂交后代的分析结果表明，AVRa6和AVRa7的无毒性均由两个位点控制[18-20]。最近的研究表明，小麦白粉菌无毒基因AvrPm3位点的情况更加复杂。对菌株96224与菌株94202的杂交后代表型分析发现，AvrPm3b和AvrPm3d的无毒位点由3个无毒位点控制[21-22]。这些结果说明多个基因参与了白粉菌与寄主之间的识别和互作。

AVRk1和AVRa10是最早从禾谷类白粉菌中克隆的无毒基因，这两个基因属于一个含有1 350个旁系同源物的大家族，EKA（effector homologous to AVRk1 and AVRa10）基因家族。功能分析证明，它们能够分别与大麦的Mlk1、Mla10互作，激发寄主防卫反应。相反，这两个基因在感病品种中表达时，则会促进病原菌的侵入[7]。这些结果反映出白粉菌无毒基因的双重功能，即在非亲和互作中的激发寄主免疫反应功能和在亲和互作中压制寄主防卫反应的功能。最近，从Bgh中克隆了两个无毒基因AVRa1和AVRa13，虽然它们在序列上没有相关性，但都能分别被大麦等位基因Mla1和Mla13识别，说明病原菌已经进化出用序列上完全不相关的无毒基因与序列上相似的R基因识别的互作模式[23]。

从Bgt中克隆的第一个无毒基因是对应于小麦R基因Pm3a和Pm3f的AvrPm3a2/f2[21]。这个基因是一个典型的CSEP编码基因。具有该基因的菌株能够被Pm3a和Pm3f识别。除了这个基因参与了对无毒性的控制之外，还存在着一个抑制基因（suppressor，Svr）对AvrPm3a2/f2起调控作用。当Svr基因起作用时，AvrPm3a2/f2表达水平不足以满足其与R基因识别，因此也不足以激发寄主防卫反应。相反，当Svr基因突变为没有功能的svr基因时，足量的AvrPm3a2/f2才能完成与R基因的互作，诱导寄主抗病反应。这种模式使得病原菌在不改变无毒基因序列的情况下，也能够通过另外一个基因在转录水平上的调控，逃避其与R基因的识别，从而增强了病原菌的适应性[8]。而且，这一互作模型证明多个基因参与了AvrPm3与Pm3的互作，不仅丰富了基因对基因学说的内容，而且说明了病原菌无毒基因与寄主R基因互作的复杂性。

最近，我们与瑞士苏黎世大学Beat Keller教授的研究团队合作，从Bgt中克隆了另一个无毒基因AvrPm2。它编码的蛋白N端含有21个氨基酸的信号肽，其信号肽下游具有保守的YFWxC基序，同时还含有卵菌的RxLR基序，具有典型CSEP的特征，能够与Pm2识别并激发寄主细胞HR反应[24]。AvrPm2在结构上与已知的RNase类核糖核酸酶具有同源性，如大麦白粉菌BEC1011（Bgh effector candidate）和BEC1054。BEC1011参与抑制寄主细胞HR反应[25]，BEC1054则能够与多个大麦蛋白互作，且对于吸器的形成是必需的。这两个效应子都参与了Bgh对大麦的致病过程[26]。这些结果说明AvrPm2可能也具有像AVRa10和AVRk1那样的双重功能。而且，RNase类核糖核酸酶可能是禾谷类白粉菌无毒基因的另一大来源。

3 禾谷类白粉菌无毒基因的变异

在寄主R基因施加的选择压力下，病原菌会通过无毒基因的变异产生对含有相应的R基因植株表现亲和的菌株。从目前已知的白粉菌无毒基因中，我们发现在无毒菌株与毒性菌株之间至少存在4种变异类型：单个氨基酸突变、连续氨基酸突变、插入突变和基因缺失。Bgt对Pm2的表型改变是由于AvrPm2所在基因组区域的12 kb的大片段缺失造成的。大片段的缺失可能是与旁侧copia转座子的同源重组事件有关。而且，在禾谷类白粉菌的另外两种专化型，黑麦白粉菌B.graminis f.sp. secalis和小黑麦白粉菌B.graminis f.sp. triticale中，保守的AvrPm2等位基因也存在类似12 kb的缺失[24]。这反映出无毒基因与其寄主R基因的协同进化关系。比较无毒菌株与毒性菌株的AVRk1序列发现三种变异：1）点突变导致蛋白提前终止;2）核苷酸插入导致移码突变;3）连续多个氨基酸的突变。AVRa10的序列变异包括单个氨基酸的改变和单个碱基插入导致的移码突变[7]。小麦白粉菌AvrPm3a2/f2在毒性菌株中由于两个氨基酸的差异而不能被Pm3a和Pm3f识别[21，27]。Bgh的AVRa1的点突变还有能够导致无毒基因功能丧失的例子[23]。另外，Bgh对Mla13亲和的毒性菌株要么通过无毒基因AVRa13提前终止，要么通过基因3′端一段连续的氨基酸突变来获得毒性[23]。以上这些变异类型在其他真菌无毒基因中均有报道。例如，油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans的AvrLm1以及稻瘟病Magnaporthe oryzae的AVR-Pia、AVR-Pii和AVR-Pik/km/kp[28-29]。稻瘟菌对Pib的毒性不仅可以通过AvrPib的点突变、基因缺失（或片段缺失）来获得，而且可以通过转座子的插入来实现[30]。尽管白粉菌无毒基因的变异与转座子等重复序列密切相关，但目前还没有在白粉菌中发现由于转座子插入带来的毒性变异。除上面提到的AvrPm2之外，Bgh无毒基因AVRa10和AVRk1所在基因家族的成员均与I型长散布核原件（long interspersed nuclear elements， LINE-1）反转座子家族（TE1a）共进化，新的变异类型可能从大量的与AVRa10和AVRk1同源的基因中进化而来[31]。

4 禾谷类白粉菌无毒基因的克隆方法

截至目前，在禾谷类白粉菌中已经发现的无毒基因（位点）中，绝大多数是通过图位克隆的方法鉴定的[8]。这种经典的遗传学方法在没有基因组序列的时代发挥了重要作用。但是，在没有参考基因组的情况下，由于重复序列的存在，通过在很宽的连锁标记区域进行染色体步移来获得无毒基因并不是十分高效。禾谷类白粉菌基因组序列的公布[11，13]为白粉菌基因的克隆和功能解析提供了非常实用的工具，显著提高了白粉菌无毒基因克隆的速度。AvrPm3a2/f2是第一个被克隆的小麦白粉菌无毒基因，该基因的克隆采用了二代测序技术和高通量基因型鉴定技术相结合的策略，大大提高了图位克隆的效率[21]。近年来，由于测序通量的提高和成本的降低，为组学分析技术在无毒基因鉴定中的应用带来了更大的空间。Praz等利用来自不同地区60个菌株的基因组序列，进行了全基因组关联分析，成功克隆了AvrPm2[24]。这一套数据可以用于多个无毒基因的筛选和克隆，避免了重复构建杂交群体的工作。最近的AVRa1和AVRa13候选基因的克隆也采用了基于测序获得的SNP关联分析法，不同的是，SNP数据是来自对侵染叶片转录组的测序[23]。考虑到大多数效应子基因在吸器中表达，这种策略有效地缩小了筛选范围，而且减少了其他基因和不表达的效应子基因的干扰。然而，白粉菌基因组含有大量的重复序列，这些序列的存在给无毒基因的克隆带来困难[11，32]。在未来的研究中，利用自然群体和杂交群体的多组学数据，直接靶向编码基因的分析策略将使得无毒基因的克隆变得更加高效。

5 展望

虽然禾谷类白粉菌无毒基因的研究在最近几年取得了显著的进展，但还有很多方面需要进一步阐明。LINE-1类无毒基因AVRa10和AVRk1具有与转座子重复序列密切相关的序列特征[31]，这类无毒基因编码产物是如何分别与Mla10、Mlk1互作，激发寄主防卫反应的？ AvrPm2编码的Avr蛋白在序列上和结构上与RNase相似，且能够激活Pm2介导的寄主细胞HR反应[24]，但仍然没有明确两者之间的互作是直接的还是间接的。这是因为AvrPm2与Bgh的AVRa13在序列上具有相似性，但是Pm2与Mla13在序列上却没有相似性。如果发生直接的互作，那么这些序列上没有相关性且来源于不同寄主的R蛋白是如何被序列上相似的Avr蛋白识别的？ 可能的解释是AvrPm2和AVRa13均能夠与寄主中1个保守的警卫蛋白（guardee）互作，且这个蛋白的变化能够被Pm2和MLA13监视。那么这些蛋白是如何行使其功能的，与Pm2之间是如何识别的还有待研究。对AvrPm3a2/f2起调控作用的基因Svr编码一个效应子，与已知的调控蛋白（例如转录因子或信号蛋白等）没有序列相似性[21]，那么这个基因是如何调节AvrPm3a2/f2的表达量的？下一步采用生物化学方法对这些蛋白进行深入的研究将有助于加深从分子层面了解无毒基因与R基因之间的互作机制。另外，尽管可以利用基因枪转化方法对基因进行瞬时表达验证，但仍然费时耗力，建立高效稳定的白粉菌遗传转化技术体系将助力无毒基因的遗传验证。

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