李君，李俊雅，梁晓

(1.湘潭医卫职业技术学院 湖南 湘潭 411102 2.南方医科大学 广东 广州 510515)

南五味子，又名华中五味子，为木兰科植物华中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果实。传统中医药认为南五味子具有收敛固涩，生津止渴，补肾宁心之功效，临床上常用于于治疗久咳虚喘，梦遗滑精，自汗盗汗，内热消渴，心悸失眠等症。现代天然药物化学、药理学研究证明：南五味子中含有多种成分，如木脂素类、挥发油类、鞣质类、有机酸类、多糖类、氨基酸类及矿物质元素等[1～4]，可有效保护大脑组织，改善心肌缺血，降低血糖，增强机体免疫功能等作用，是典型的名贵中药之一，也是我国三级保护的野生药材物种。

南五味子广泛分布于秦岭——淮河以南的多数省份，尤其以湖北省、四川省、江西省最为出名。随着最近2年国家的“精准扶贫”政策，广大山区种植中药材业已成为不少农村脱贫致富的好途径，但是作为人工栽培种植的药材，南五味子尚缺乏综合的评价标准，果实的采收期国内无统一的规范。为了科学、客观的评价南五味子的药材质量，确定药材的最佳采收期，我们采用五味子酯甲、南五味子多糖、熊果酸、总鞣质、水溶性浸出物、醇溶性浸出物等为指标，对不同采收期的南五味子果实中主要成分含量的变化进行了研究[5-7]。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料

研究所用南五味子样品分别在国内3个省区(湖北神农架自然保护区、四川省都江堰市青城山区、江西省宜春市武功山区)收集，共18份，经湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定，样品均为木兰科植物华中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的果实。南五味子果实成熟时采摘，除去果梗和杂质，晒干，备用。

1.2 试剂

五味子酯甲对照品(中国食品药品检验研究院，批号：112640-201709)，熊果酸对照品(中国食品药品检验研究院，批号：110742-201612)，四氢呋喃、乙腈、甲醇、异丙醇为色谱纯(天津四友精细化学品有限公司)，干酪素、葡萄糖，实验研究所用其它试剂均为分析纯。

1.3 仪器

高效液相色谱仪(Waters600，美国Waters公司)，紫外检测器(Waters468，美国Waters公司)，Watres PC800色谱工作站。超声波清洗器(YQ-520C，上海易净超声波仪器有限公司)，电子天平(BS224S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

2 方法与结果

2.1 五味子酯甲的含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适应性试验 菲罗门色谱柱ODS(150 mm×4.6 mm，4 μm)；流动相为：四氢呋喃-水=40∶60；流速1 mL·min-1；柱温25 ℃；检测波长254 nm。在此条件下，五味子酯甲保留时间为7.6 min，与其它相邻色谱峰分离度大于1.5，且阴性对照对照品无干扰。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取五味子酯甲对照品3.15 mg，加甲醇制成每1 mL含量0.042 mg的溶液，摇匀，即得。

2.1.3供试品溶液的制备 取南五味子粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，称定重量，超声处理0.5 h，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱，测定，即得，结果见图1、图2。

图1 五味子酯甲对照品色谱图

图2 南五味子样品色谱图

2.1.5 线性关系考察 精密吸取标准品溶液，分别吸取2.5、5、10、15、20 uL进样，以峰面积(X)为横坐标，五味子酯甲对照品含量(Y)为纵坐标，得回归方程为：Y=373 308X+24 620，r=0.999 7，说明五味子酯甲在4.01～24.4 μg范围内线性良好。

2.1.6 方法学考察 分别考察了仪器精密度、重复性，样品的稳定性和加样回收率，均达到了实验研究要求的标准。

2.2 南五味子中熊果酸的含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Hypersil ODS(200 mm×4.0 mm)，流动相为乙腈-水-磷酸=85∶15∶0.1，流速1 mL·min-1，检测波长213 nm，柱温：20 ℃，理论塔板数大于8000，分离度大于1.5。

2.2.2 对照品溶液的制备 取熊果酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1 mL含量0.5 mg的溶液，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取南五味子粉末约0.5 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加入无水乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声提取30 min，放冷至室温，称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱，测定，即得。结果见图3、图4。

图3 熊果酸对照品色谱图

图4 南五味子样品色谱图

2.2.5 线性关系考察 精密吸取标准品溶液，分别吸取依次以1、2、4、8、10 uL进样，进行HPLC分析。以峰面积(X)为横坐标，熊果酸对照品含量(Y)为纵坐标，得回归方程为：Y=6.763 34×10-6X-0.586 2，r=0.999 8，说明熊果酸在0.506～4.860 μg范围内线性良好。

2.2.5 方法学考察 分别考察了仪器精密度、重复性，样品的稳定性和加样回收率，均达到了实验研究要求的标准。

2.3 南五味子多糖的含量测定

2.3.1 南五味子多糖的制备 取南五味子粗粉100 g，加95%乙醇300 mL回流1 h，纯提后的南五味子药材残渣加蒸馏水1000 mL，回流提取2次，每次1 h，滤过，合并滤液，再将滤液浓缩至100 mL，用氯仿-正丁醇(2∶1)萃取2次，水层加95%乙醇使含醇量达到80%，静置过夜，抽滤，残渣依次用乙醇、丙酮、乙醚洗涤多次，挥干有机溶剂，得南五味子多糖[8]。

2.3.2 标准曲线的制备 精密吸取标准溶液10、20、40、60、80、100 μL，分别置于10 mL具塞容量瓶中，稀释至刻度，另取10.0 mL蒸馏水作空白对照实验。各容量瓶分别取出2.0 mL于试管中后，加入2.0 mL蒽酮溶液，再加入浓硫酸3.0 mL(12 mol·L-1)，摇匀后放置10 min，置水浴90 ℃中加热10 min，取出冷却后，在波长623 nm处测定吸光度。以南五味子多糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，得线性回归方程Y=70.804 3X+0.005 7，r=0.999 7。说明在(10.6～101.8)μg范围内五味子多糖的含量与吸光度呈良好的线性关系。

2.3.3 南五味子多糖的含量测定 精密吸取样品溶液2.0 mL，置于试管中，加入2.0 mL蒽酮溶液，混匀，再加入浓硫酸3.0 mL，摇匀后放置5 min，置沸水浴90 ℃中加热10 min，取出冷却后，在波长623.0 nm处测定吸光度，按标准曲线项下方法测定吸收度，依回归方程求得南五味子多糖的含量。结果见表1。

2.4 南五味子总鞣质的含量测定

采用《中华人民共和国药典》2015版四部中关于鞣质含量测定法项下测定方法测定，并对所使用的干酪素进行空白对照试验[9]。方法学考察结果符合要求，测定结果见表1。

2.5 南五味子水溶性浸出物的测定

采用《中华人民共和国药典》2015版四部中关于浸出物测定法项下“水溶性浸出物的测定方法”测定[8-9]，方法学考察结果符合要求，测定结果见表1。

2.6 南五味子醇溶性浸出物的测定

采用《中华人民共和国药典》2015版四部中关于浸出物测定法项下“醇溶性浸出物的测定方法”测定[8-9]，方法学考察结果符合要求，测定结果见表1。

2.7 主成分分析

主成分分析法是把多指标转化为少数几个综合指标(即主成分)，其中每个主成分都能够反映原始变量的大部分信息，且所含信息互不重复。本文运用SPSS统计分析软件对测定结果进行相关主成分分析[10-11]。南五味子各项指标数据标准化完成之后，然后确定主成分个数及相关系数，即可得出主成分表达式。南五味子主成分表达式如下：

Y五味子=五味子酯甲×0.415-熊果酸×0.421+多糖×0.408-总鞣质×0.395+水浸物×0.401-醇浸物×0.407

(1)

2.8 不同采收期南五味子药材中各成分含量的测定结果

运用上述方法分别对不同产区、不同采收期南五味子中主要成分进行测定，结果见表1。

2.9 南五味子不同采收期样品综合分析结果

根据(2.7)项下南五味子主成分计算公式，分别计算出不同采收时间南五味子药材的综合数据得分并排序。结果见表2。

表1 不同产区南五味子主要成分的含量测定结果

表2 3个产地不同采收时间南五味子药材综合分析结果

3 讨论

研究结果表明湖北、四川、江西三个产区的南五味子有些化学成分的积累呈一定的规律性：从8月中旬到10月下旬，南五味子药材中熊果酸的含量和总鞣质的含量呈下降趋势，五味子酯甲的含量在9月中旬达到高峰，南五味子多糖的含量在9月下旬达到高峰；而南五味子水溶性浸出物和醇溶性浸出物没有呈现明显的规律性变化。

根据主成分分析法结合得分结果排序，我们初步确定南五味子最佳采收期均为9月中下旬。同时，研究还发现湖北、四川、江西三个产区南五味子在9月中旬到9月下旬之间主要化学成分的得分最高，但是三个产区之间略有差异。这可能是因为三个产区南五味子生长环境所需的水分、温湿度、土壤等条件不同的所致，具体原因有待进一步研究[12]。