王青青，方明月，刘双月，李德利，马超，孙爱东*，王如峰*

(1.北京中医药大学 生命科学学院，北京 102488；2.北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083)

青风藤为防己科植物青藤Sinomeniumactum(Thunb.)Rehd.et Wils.及毛青藤S.acutum(Thunb)Rehd.et Wils.var.cinereumRehd.et Wils.的干燥藤茎[1-2]。青风藤分布于长江流域及其以南各地，如河北、河南、安徽、江苏、浙江、福建、广东、广西、湖北、四川、贵州、陕西等地[1]，毛青藤分布于湖北、四川、云南、贵州、陕西等地[2]。中医应用青风藤或其复方治疗风湿性疾病已有一千多年的历史[3]，《图经本草》和《本草纲目》中有记载“青风藤治风湿流注，历节鹤膝，麻痹瘙痒……”[4]，《中华人民共和国药典》(《中国药典》)2015版一部收载青风藤，并在防己黄芪汤、芪麝丸等复方中药中有所应用。青风藤中含有多种生物碱类化学成分，包括青藤碱、木兰花碱、尖防己碱、四氢表小檗碱、异青藤碱、土杜拉宁、N-去甲基尖防己碱、白兰花碱、光千金藤碱等30多个生物碱[4]，主要成分为青藤碱和木兰花碱。《中国药典》[5]中收载了青藤碱的含量测定项，并规定青风藤中青藤碱的含量不得低于0.50%。木兰花碱是青藤碱的同系物，二者都有类似的菲核结构[6](见图1)，且药理作用也相似[7-10]。因此，木兰花碱的含量对青风藤的质量评价也有重要价值。为此，本文建立了同时测定青风藤中这两个成分的含量测定方法，并利用该方法对从全国各地收集的62批市售青风藤中青藤碱和木兰花碱的含量进行了测定。

图1 青藤碱和木兰花碱化学结构式

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪(Waters 公司)，BP211D 型 1/10 万电子天平(Sartorious公司)，Synergi Polar -RP 苯基 C18色谱柱，KQ-500型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)，400Y型多动能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)。

1.2 试剂与药品

62批青风藤饮片分别在2015—2018年购于全国14个省的药材市场或中药店，经北京中医药大学王如峰教授鉴定为正品，凭证标本保存于北京中医药大学生命科学学院，样品信息见表1。青藤碱、木兰花碱对照品购于赛谱锐思(北京)科技有限公司，其纯度不低于99%。色谱试剂乙腈为色谱纯(Fisher公司，美国)，乙酸和乙醇均为分析纯，水为市售屈臣氏蒸馏水。

表1 62批青风藤饮片样品信息

2 方法与结果

2.1 液相色谱条件及系统适用性试验

色谱柱为 Synergi Polar-RP苯基C18柱(250 mm×4.6 mm，4m)，流动相为乙腈(B)-1%乙酸水溶液(A)，梯度洗脱(0～15 min，10%→15% B；15～17 min，15%→20% B；17～22 min，20%→40% B；22～30 min，40%→40% B)，柱温为30 ℃，检测波长为280 nm，流速为1 mL·min-1。采用上述色谱条件分别得到对照品和青风藤饮片提取液的HPLC色谱图，如图2所示。样品中青藤碱、木兰花碱的保留时间分别为10.50、21.72 min，理论塔板数分别为1532和6060，拖尾因子分别为0.98和1.01。

注：A.混合对照品；B.样品；1.青藤碱；2.木兰花碱。图2 青风藤及对照品HPLC图

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取对照品青藤碱10.06 mg和木兰花碱10.03 mg，置于10 mL容量瓶中，加70%乙醇水溶液溶解并稀释至体积，4 ℃保存备用。进样前，取适量对照品溶液稀释至0.1 mg·mL-1。

2.3 供试品溶液制备

称取适量青风藤饮片，用粉碎机粉碎至粉末，过三号筛。精密称取0.10 g，置于50 mL锥形瓶中，用移液管加入70%乙醇水溶液20 mL，称质量。超声提取30 min，放置室温，再称定质量，用70%乙醇水溶液补足减失的质量。摇匀过滤，取续滤液，用0.45m微孔滤膜滤过[4-5，11]，即得供试品溶液。

2.4 标准曲线制备

精密配制1 mg·mL-1的青藤碱和木兰花碱对照品混合溶液，用70%乙醇水溶液分别稀释得到质量浓度为0.01、0.025、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg·mL-1的对照品混合溶液。按上述色谱条件测定，分别进样10L。以测定峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标进行线性回归，得到回归方程，青藤碱：Y=5×106X-3 780.8(r=0.999 6)，木兰花碱：Y=1×107X+67 608(r=0.999 5)，结果表明青藤碱和木兰花碱在0.01～0.40 mg·mL-1线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密量取按2.2项下方法制成的青藤碱和木兰花碱对照品溶液，连续进样6次，进样量均为10L，测定青藤碱和木兰花碱的峰面积。据此计算青藤碱和木兰花碱色谱峰的RSD分别为1.26%和0.36%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品(编号：QF090ZK02)溶液，分别在0、2、4、8、12、24、48 h各进样1次，进样量均为10L，根据峰面积考察样品的稳定性。计算得出青藤碱和木兰花碱色谱峰的RSD分别为1.52%和1.83%，表明供试品在48 h内稳定。

2.7 重复性试验

精密称取供试品(编号：QF090ZK02)6份，按2.3制成供试品溶液，按2.1色谱条件分别进样10L测定。计算青藤碱和木兰花碱色谱峰的RSD分别为0.45%和0.93%，表明该方法重复性良好。

2.8 检测下限与定量下限测定

按2.2制成两种对照品溶液，逐渐稀释，按2.1色谱条件连续进样，记录峰面积，直至S/N=3 和S/N=10，此时的进样量即分别为检测下限(LOD)和定量下限(LOQ)。测得青藤碱和木兰花碱的检测下限分别为0.64、0.72 ng，定量下限分别为2.05、2.40 ng。

2.9 回收率试验

精密称取同一供试品(编号：QF051AG14)6份，每份 0.10 g，分别定量加入2种对照品，按2.3法制成供试液，按2.1色谱条件，测定样品中相应的生物碱含量，计算加样回收率。青藤碱和木兰花碱回收率分别为95.99%和99.11%，说明该方法的回收率良好。结果见表2。

表2 青风藤中青藤碱和木兰花碱的加样回收率试验结果

2.10 含量测定

取62批市售青风藤饮片，按2.3制成供试品溶液，按2.1色谱条件每批测定3份，分别进样10L，测得青藤碱和木兰花碱的质量分数分别为0.236%～4.735%和0.256%～3.682%，结果见表3。

3 讨论与结论

本研究建立了青风藤中青藤碱和木兰花碱的 HPLC含量测定方法，并用该方法成功测定了来自全国各地的62批市售青风藤中青藤碱和木兰花碱的含量。除了4批经性状和显微鉴定为混伪品未测出这两个成分之外[12]，其余58批中青藤碱和木兰花碱质量分数均值分别为2.034%和1.293%。青藤碱最高值为4.735%，最低值为0.236%，只有一批样品的含量低于2015版《中国药典》规定的最低0.5%的要求。木兰花碱最高值为3.682%，最低值为0.256%。以上数据说明，2015—2018年市场上销售的青风藤质量基本符合《中国药典》要求，但存在混伪品和个别正品青藤碱含量不合格的现象，并且合格正品中青藤碱和木兰花碱的含量差异也较大。正品青风藤中青藤碱和木兰花碱含量差异较大可能与青风藤的产区跨度大及各地气候、土壤、栽培条件存在差别有关。另外，入药物种的差别也是造成不同批次中青藤碱和木兰花碱含量差异的因素。

表3 62批市售青风藤中青藤碱和木兰花碱的含量测定 %

注：—表示未检测到。

经数据统计发现，青藤碱和木兰花碱的含量大体上呈正比趋势，青藤碱含量高的青风藤中木兰花碱含量也相对偏高。这可能与两个生物碱的结构相似、生物合成路径也相似有关。本研究建立的同时测定青风藤中两个生物碱的含量测定方法及测定结果，可为青风藤的质量评价提供科学参考。