张烨华，米荣升,2，程 龙，黄 燕,2，贾海燕，张晓丽，游艳敏，韩先干，陈兆国,2

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室（上海） 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

弓形虫病（toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种呈世界性分布人兽共患寄生虫病，严重危害着人类健康[1]。弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，既可感染人，也可感染家畜。全世界约三分之一的人为弓形虫慢性感染者，感染初期的成人通常没有明显的症状，但孕妇感染后会导致非常严重的后果，如早产、流产、死胎及胎儿畸形等。许多畜禽，如猪、牛、猫、犬、羊、马、兔、鸡、鸭等都可以感染弓形虫并出现症状，其中猪的感染率最高，危害也很严重。20世纪80年代，弓形虫病曾在我国猪场大规模暴发流行，死亡率高达60% 以上，给养猪生产造成巨大的经济损失[2]。

在我国，猪肉是人们生活中最主要的动物性食物来源，弓形虫感染的猪及其肉制品对人类健康构成了极大威胁。若吃了生的或未煮熟的已感染弓形虫的肉制品，食用者就有可能被感染。因此，了解猪肉中弓形虫的携带状况，对保障猪肉质量安全具有重要意义。建立简便、快捷、高效的弓形虫检测方法，对于准确了解猪是否感染，猪肉中是否携带弓形虫是十分必要的[3]。

鉴于猪感染弓形虫后临床症状不明显、不典型，血清学方法成为较常用的诊断方法，但是该方法不能对猪肉中是否携带弓形虫进行检测。常规显微镜镜检主要针对胸腹腔积液、羊水、脑脊液、骨髓、血液离心沉淀物或组织穿刺物涂片，很容易漏检。近年来，以PCR为基础的分子生物学检测方法因其具有的高敏感性、迅速等优点而越来越受到人们的关注[3]。但是不同文献报道的PCR检测方法的敏感性差异很大[4-7]。应用分子检测方法，我国部分地区开展了猪肉中弓形虫携带情况的调查研究，结果显示其阳性率在0～18.03%之间。余莉等[5]对合肥市100份猪肉样品进行PCR检测，阳性率为17.00%（17/100）。Wang等[8]应用定量PCR检测了安徽省部分地区猪肉中弓形虫携带情况，阳性率为18.03%（75/416）。李亚丽等[9]对河南省漯河市市售猪肉进行了检测，阳性率为4.00%（8/200）。詹婷婷等[10]对重庆、广州和上海3个城市的猪肉样品进行了检测，重庆的阳性率为9.83%（17/173），上海为3.17%（4/126），而广州则未检出阳性样品（0/94）。不同地区猪肉中弓形虫的阳性率存在较大差异，可能与采用方法的敏感性有关，也很有可能与提取样品DNA的质量及效率相关。为寻找高效、稳定、快速、经济的猪肉中弓形虫DNA提取方法，本试验将一定数量的弓形虫速殖子加入猪膈肌中，用不同试剂盒提取样品DNA进行PCR检测。

1 材料与方法

1.1 虫株、DNA及猪膈肌样品弓形虫PRU株速殖子以及微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、泰泽隐孢子虫（C. tyzzeri）、贝氏隐孢子虫（C. baileyi）、柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）卵囊，以及牛带绦虫（Taenia saginata）、日本血吸虫（Schistosoma japonicum）和旋毛虫（Trichinella spiralis）幼虫由中国农业科学院上海兽医研究所动物源性病原生物学及食品安全创新团队保存。猪膈肌样品126份，采自上海市某屠宰场，采集后分装，-20℃保存备用。

1.2 主要试剂及DNA提取试剂盒海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（货号：DP33）购自上海晶科生物有限公司；EZNA Tissue DNA Kit（货号：D3396-01）购自OMEGA BIO-TEK公司；GeneJET Genomic DNA Purification Kit（货号：K0721）购自Thermo Scientific 公司；TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 （货号：9765）购自宝生物工程（大连）有限公司；TIANamp Genomic DNA Kit（货号：DP304-03）购自天根生化科技（北京）有限公司；FastDNA Spin Kit for Soil（货号：116560-200）购自MP公司。TaKaRa Ex Taq DNA 聚合酶、dNTP Mixture为宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA Marker DL 2000为北京全式金生物技术有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 含不同数量弓形虫猪膈肌样品的制备取经分子检测为弓形虫阴性的猪膈肌样品，用无菌剪刀剪碎，加入适量PBS。样品用均质仪震荡破碎，分成5份，每份3.0 g。随后分别加入6×100、6×101、6×102、6×103、6×104个弓形虫速殖子，每份样品加PBS定容至6 mL，混匀后将每个浓度样品分成6管，每管1 mL，-20℃保存。另取2份猪膈肌样品，用同样方法重复处理，用于DNA提取。

1.4 猪膈肌中弓形虫 DNA 的提取选取6种不同DNA提取试剂盒，分别提取制备的速的猪膈肌混悬样品的基因组DNA，每种方法中每个浓度样品重复3次。所有操作均严格按各自试剂盒的操作说明进行。提取的DNA置于-20℃保存，用于分子检测。

1.5 引物合成参照文献[5]，合成弓形虫529 bp重复序列引物，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。Toxo-529-F(上游引物):5'-CTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3'，Toxo-529-R(下游引物): 5'-CTGCAGACACAGTG CATCTGGATT-3'。

1.6 PCR 扩增对弓形虫529 bp重复序列进行扩增，反应体系：ddH2O 16 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL、TaKaRa Ex Taq 0.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、样品DNA 2 μL。反应条件：94℃预变性7 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃再延伸10 min。扩增产物用1.0% 琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.7 不同方法提取的速殖子DNA用于PCR检测的敏感性试验用6种试剂盒分别提取含有不同数量弓形虫速殖子的猪膈肌样品的DNA，作为模板分别进行PCR扩增，扩增方法同1.6。用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物检测，观察每种方法的敏感性。所有提取方法均重复3次。

1.8 特异性试验选取敏感性高、重复性好、价格相对低廉的DNA提取方法，提取含1×104个弓形虫速殖子的猪膈肌样品的DNA，以及牛带绦虫、旋毛虫、日本血吸虫成虫、柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、微小隐孢子虫、泰泽隐孢子虫、贝氏隐孢子虫卵囊DNA，分别进行PCR扩增，检测PCR方法的特异性。

1.9 市场采集样品的检测选取提取效率高、价格相对低廉的DNA提取方法，对实验室2015年从上海市某屠宰场采集的126份田间猪膈肌样品，进行DNA提取，作为模板，分别进行PCR检测，并与本实验室之前采用另一种方法对同一批样品提取的DNA的检测结果[10]进行比较。

2 结果与讨论

2.1 不同方法提取的速殖子DNA用于PCR检测的敏感性比较对添加了不同数量弓形虫速殖子的猪膈肌样品，采用6种DNA提取试剂盒分别进行基因组DNA提取。各种试剂盒提取的基因组DNA的OD260/OD280比值均在1.8～2.0之间，可以用于下一步的PCR检测。

以提取的DNA作为模板，分别进行PCR检测，进行3次重复。结果显示，以不同方法提取的速殖子DNA为模板进行PCR检测，敏感性存在差异。EZNA Tissue DNA Kit和TIANamp Genomic DNA Kit提取的DNA进行PCR检测的敏感性最高，2次对含有1×101个及以上速殖子、1次对1×102个及以上速殖子的猪膈肌样品提取的DNA检测为阳性；其次是FastDNA Spin Kit for Soil，1次对含1×101个速殖子及以上样品、2次对含1×102个速殖子及以上的样品检测为阳性；GeneJET Genomic DNA Purification Kit 2次对1×102个速殖子及以上、1次对1×103个速殖子及以上样品检测为阳性；而海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒和TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，只能检测出含1×103个速殖子及以上的样品（图1、表1）。

PCR结果比较显示，EZNA Tissue DNA Kit、TIANamp Genomic DNA Kit 和FastDNA Spin Kit for Soil提取DNA进行PCR检测的敏感性最高。在这三种试剂盒中，FastDNA Spin Kit for Soil操作繁琐，价格昂贵；EZNA Tissue DNA Kit提取所耗时间和TIANamp Genomic DNA Kit 相差不大，但是价格相对TIANamp Genomic DNA Kit 更加昂贵。因此，三种试剂盒中TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒不仅敏感性高、特异性好，而且价格经济实惠。沈海英等[11]比较了5种提取弓形虫速殖子基因组 DNA的方法，分别为试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯

仿法和盐析法，发现酚-氯仿法效果最好，能够扩增出的最低值为1×101个速殖子。但是该检测只是单纯的提取速殖子基因组，并未模拟猪膈肌中弓形虫的感染情况，对于猪膈肌中存在的弓形虫DNA的提取结果可能会存在差异，而且酚-氯仿法操作繁琐、费时、对操作者存在一定毒性，不适合大批量市售猪膈肌样品的检测。本研究模拟了猪膈肌中弓形虫感染情况，筛选到了3种简便、快捷、高效的适合于猪膈肌中弓形虫分子检测的DNA提取方法，其中TIANamp Genomic DNA Kit提取法更加经济实惠，适合于开展大规模的田间猪肉样品中弓形虫携带调查研究。

A： 海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒; B： EZNA Tissue DNA Kit; C： GeneJET Genomic DNA Puri fication Kit; D： Takara MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0; E： TIANamp Genomic DNA Kit; F： FastDNA Spin Kit for Soil; 1： 添加1×100 弓形虫速殖子; 2： 添加1×101弓形虫速殖子; 3：添加1×102弓形虫速殖子; 4： 添加1×103弓形虫速殖子; 5： 添加1×104弓形虫速殖子; N： 阴性对照; M： DNA分子量标准(DL 2000)A： Marine Animal Tissue Genomic DNA Extraction Kit; B： EZNA Tissue DNA Kit; C： GeneJET Genomic DNA Puri fication Kit; D：Takara MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0; E： TIANamp Genomic DNA Kit; F： FastDNA Spin Kit for Soil; 1：1×100 tachyzoites were added; 2： 1×101 tachyzoites were added; 3： 1×102 tachyzoites were added; 4： 1×103 tachyzoites were added; 5：1×104 tachyzoites were added; N： Negative control; M： DNA Marker(DL 2000)

表1 6种试剂盒提取DNA的PCR检测结果Table 1 PCR detection results of DNAs extracted by 6 kinds of kits

2.2 TIANamp法提取DNA用于PCR检测的特异性试验采用TIANamp Genomic DNA Kit方法对含 1×104个速殖子样品提取DNA，与牛带绦虫、旋毛虫、日本血吸虫、柔嫩艾美耳球虫、微小隐孢子虫、泰泽隐孢子虫和贝氏隐孢子虫DNA分别进行扩增。结果显示，只有弓形虫速殖子样品DNA在529 bp处出现1条目的条带，其他寄生虫DNA均未扩增出目的条带（图2）。

图2 TIA Namp法提取弓形虫DNA的PCR特异性检测结果Fig. 2 Speci fic test of PCR for Toxoplasma gondii DNA extracted by TIA Namp法

拷贝数多的目的基因有助于提高PCR检测的敏感性和特异性[12]。Homan等[13]发现了1个529 bp的弓形虫特异性基因，命名为弓形虫529 bp重复序列，该基因在弓形虫基因组中多达 300 多个拷贝。以该基因为目标检测基因，方强等[14]建立了常规PCR诊断方法，发现该方法具有很好的特异性。余莉等[5]选取不同基因对猪肉中弓形虫携带情况进行检测，发现弓形虫529 bp重复序列的敏感性最高。张莹光等[15]建立了基于该序列的巢式PCR，可以检测出0.1 pg的弓形虫基因组DNA。孟鹏等[16]利用该基因设计半巢式PCR引物，检测了土壤样品中的弓形虫。Bourdin等[17]利用该基因对人的血液和泪液样本进行了检测。徐前明等[18]利用该基因建立了弓形虫环介导等温扩增（LAMP）检测方法。本课题组詹婷婷等[10]也利用该方法对猪肉样品中的弓形虫进行了检测。本研究选用该基因做为靶基因，对不同试剂盒提取的DNA模板进行检测，发现以该基因为引物的PCR方法具有很好的特异性，这与文献[14]研究结果相似，529 bp重复序列只能扩增弓形虫DNA，对于健康志愿者全血、正常小鼠全血、间日疟原虫、恶性疟原虫及结核杆菌基因组 DNA 均未能扩增出。

2.3 市售猪膈肌样品的检测对采集的126份猪膈肌样品，用TIANamp Genomic DNA Kit提取基因组DNA，进行PCR扩增。结果显示，共有5份弓形虫阳性样品（图3），阳性率为3.97%。序列测定结果显示，所有阳性扩增产物序列与GenBank登录的刚地弓形虫RH株529 bp重复区序列（登录号：AF146527）同源性达100%。采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 提取的CPR结果为样品中弓形虫阴性率为3.17%（4/126）[10]。两种方法提取的DNA检测结果阳性符合率为100%，阴性符合率为99.18%，表明采用TIANamp Genomic DNA Kit 提取DNA，能够提高猪肉样品的检出效率。当然，这一结论仍需更多样品的检验结果来验证。

图3 部分市售猪膈肌样品PCR检测结果Fig.3 PCR detection of partial diaphragm samples