郭爱民，段成任，杨昆明，谢志胜，焦 丽，马江霞，岳 城

（新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052）

异尖线虫病（Anisakiasis）是由异尖科线虫第三期幼虫引起的食源性寄生虫病，主要病原包括对盲囊线虫（Contracaccum spp）、宫脂线虫（Hysterothylacium spp）、简单异尖线虫（Anisakis simplex）、抹香鲸异尖线虫（Anisakis physeteris）、典型异尖线虫（Anisakis typica）、拟地新线虫（Pseudoterranova decipiens）[1-2]。鱼类感染异尖科线虫一般表现不明显，但可影响鱼的生长，严重感染时可造成鱼体腹部膨胀，异尖线虫寄生于肝脏时可引起鱼体体重下降和器官萎缩。当人误食含有异尖线虫的生鱼片时，会出现腹痛、恶心、呕吐的症状，严重时表现为风疹、水肿甚至呼吸障碍、过敏性休克[3-7]。

随着异尖线虫对海水鱼类感染率的升高，以及鲜食生鱼的饮食时尚的兴起，全球人类感染异尖线虫的病例已达3万多，并呈上升趋势[8]，我国也有人体感染异尖线虫的病例报告[9]。异尖线虫寄生于海水鱼，我国各海域及10多个沿海省市均有异尖线虫的报道[10-17]。异尖线虫已列入我国水产品质量安全检测的重要病原，异尖线虫病已列入我国禁止入境的二类动物疫病。

新疆维吾尔自治区地处欧亚大陆腹地，远离海洋，但随着“一带一路”的建设，水产品保存技术的提高和交通运输的迅速发展，新疆市场上的海水鱼及制品也越来越多。2017年8月我们对新疆乌鲁木齐市售海鱼进行抽样检查，发现5只虫体疑似异尖线虫，因此对其进行了形态学和分子生物学鉴定。

1 材料与方法

1.1 样品来源2017年8月，从乌鲁木齐市各市场及水产超市随机购买海鱼，带回实验室分离组织，检查有无虫体和包囊，并详细记录，分离的虫体洗净后保存于70%酒精中。

1.2 形态学鉴定将虫体从70%酒精中取出，经苯酚-乳酸-甘油透明液透明后制片，在显微镜下观察并拍照测量，参照《异尖线虫病诊断规程》[18]进行鉴定。

1.3 分子生物学鉴定将虫体从70%酒精中取出，置于灭菌的1.5 mL离心管中，超纯水复水3 h后用研磨棒磨碎，根据Omega软体动物DNA小量提取试剂盒的步骤提取虫体基因组DNA。引物为异尖科线虫ITS序列的通用引物，上游引物：NC5（5'-GAA TTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA-3'），下游引物：NC2（5'-GCCGGATCCGAATCCTGG TTAGTTTCTTTTCCT-3'），引物由上海生工有限责任公司合成。PCR反应体系（50 μL）：Super mix 25 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、底物2 μL、ddH2O 21 μL。PCR反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃再延伸10 min。扩增产物进行1%琼脂糖电泳分析，目的条带切胶后用OMEGA公司的胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物送上海生工生物公司进行测序。测序结果通过BLAST比对，用MEGA 6.0软件做多重比较并构建系统发育树。

2 结果与讨论

2.1 形态学鉴定在冰鲜鳕鱼块中发现虫体5只，显微镜观察形态基本一致。虫体呈黄白色，体长18～25 mm，体宽0.32～0.41 mm，体表具有明显的角质环纹，头部钝圆（图1A）；头部顶端有一钻齿，钻齿高10.1～10.8 μm，口近似三角形，周围有3个略呈梯形的唇片，钻齿下方可见圆形的排泄孔（图1C）；食道长1.235～1.437 mm，宽0.075～0.102 mm，前端细，向后逐渐膨大，神经环呈黑点状距头端0.257～0.352 mm；胃呈圆筒形，黑色而不透明；无胃盲囊和肠盲囊，胃与肠以斜线相连（图1B），肠腔呈“Y”型；尾短，周围有很多横纹，顶端有一尾突，呈圆塔形（图1D），符合异尖线虫Ⅰ型的典型特征[18]。属于异尖线虫Ⅰ型的幼虫有简单异尖线虫、派氏异尖线虫、典型异尖线虫和剑吻鲸异尖线虫（Anisakis ziphidarum）[19]。但由于幼虫虫体差异小，在光镜下只能对线虫幼虫鉴定到属，形态特征相似的同属不同种线虫一般很难用形态学方法区分。

2.2 序列分析样品测序结果经BLAST分析比对，本研究所得到的异尖线虫序列（AN1～5）与GenBank上发表的简单异尖线虫（A. simplex）的序列（登录号：KY275505.1、KY275506.1、KX550939.1）相似性高达99%～100%。系统发育分析表明，AN1～5与GenBank上下载的简单异尖线虫（登录号：KY275505.1、KX550939.1）构成一个自展值为 83%的拓扑结构分支，7个简单异尖线虫又与派氏异尖线虫（A. pegreffii）构成一个自展值为 100% 的拓扑结构分支。

图1 异尖线虫Ⅰ型3期幼虫显微镜观察Fig.1 Micrograph of Anisakis typeⅠthird stage larva

图2 基于核糖体ITS序列的异尖线虫系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of Anisakis based on the sequence of ribosomal ITS

随着分子生物学技术的发展，DNA条形码可为寄生虫的鉴定提供可靠的数据，被称为分类鉴定和遗传进化分析的“黄金标准”[20]。本研究的序列与韩国报道的鳕鱼体内的简单异尖线虫（GenBank登录号：KY275505.1）相似度高达99%，且5个序列与简单异尖线虫（GenBank登录号：KY275505.1、KX550939.1）聚成的拓扑结构自展值为83%，两种简单异尖线虫又与派氏异尖线虫聚为一枝，说明在异尖属线虫中派氏异尖线虫和简单异尖线虫的遗传距离最近，这也可能是研究早期把派氏异尖线虫当作简单异尖线虫姊妹种的潜在原因[21,22]。同时，系统发育树也显示异尖线虫Ⅰ型的四种虫体聚为一枝，并与两种异尖线虫Ⅱ型聚为一个更大的分支，这与形态学特点相符。

Brier[23]的研究表明异尖线虫在50℃～55℃、10 s内可以死亡，在-20℃冷冻24 h后便可全部死亡。海鱼冰鲜保存和运输的温度为-4℃，异尖线虫在该温度可能不会死亡，可随冰鲜运输从沿海到达内陆地区，因此存在扩散的风险。新疆地处欧亚大陆的中心，离海洋较远，以前未见异尖属线虫病的报道。这次我们从沿海地区运输至乌鲁木齐的冰鲜鳕鱼块中发现了异尖线虫，说明随着交通日益发达和水产品运输方式的发展，存在异尖线虫被携带至远离海洋的内陆地区的可能性。

新疆是连通欧亚大陆的重要枢纽，是第二座“亚欧大陆桥”的必经之地，是与“一带一路”沿线国家进行贸易往来的重要门户。随着“一带一路”战略的实施和瓜达尔港的建设，将会有更多来自北冰洋、地中海、印度洋的水产品通过新疆进入国内市场，这也增加了水产品病原扩散的风险。而食品安全问题是广大人民群众最现实、最直接、最关心的重大问题，它不仅与消费者的切身利益紧密相连，也与政府形象密切相关，更是社会和谐和国家长治久安的基础[24]。

本研究首次在远离海洋的乌鲁木齐市发现随海鱼运输携带到新疆的异尖线虫，需要引起社会各界广泛关注。建议检疫部门加大对水产品的检疫力度，防治病原扩散，为人民的健康保驾护航。