张晓锋，翁永刚，陈 冈，李守富，郭 海，叶结平，范红结，陈鸿军

（1.南京农业大学动物医学院，南京210095；2.上海市金山区农业委员会，上海201500；3.上海市金山区动物疫病预防控制中心，上海201500；4.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

I型牛疱疹病毒（Bovine herpesvirus 1，BHV-1）又称传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinortracheitis virus，IBRV），主要引起牛的一种急性、热性、接触性传染病，造成传染性坏死性鼻炎（即“红鼻病”），可导致机体细胞免疫功能降低和免疫抑制，易引起继发感染。BHV-1主要通过空气、媒介物或者与病牛直接接触而传播，传染性强，对产奶、繁育及使役均有较大影响[1-2]。

目前已证实gC、gE为BHV-1非病毒复制所必需的基因，是构建缺失疫苗的缺失对象。国外很早就将包括gE缺失的单基因缺失苗、双基因缺失苗以及三基因缺失苗应用于生产实践，其中gE基因缺失苗免疫可以在早期产生免疫应答，在爆发早期使用可以有效的预防病毒流行。但是基因缺失疫苗的使用，迫切需要高灵敏度、高通量的检测方法与之配套。由于疱疹病毒均含有gE基因且较为保守[3]，因此，本研究根据BHV-1 gE基因保守序列，设计1对特异性引物，建立了荧光定量PCR方法，为鉴别BHV-1野毒株和gE基因缺失疫苗株的感染提供技术手段。

有调查报告显示上海市金山区奶牛中存在一定程度的BHV感染，并且因继发感染引起肺炎等疾病的现象也较为严重[4]。本研究通过建立的荧光定量PCR对2015～2016年采集的500份牛鼻腔棉拭子和100份阴道棉拭子进行检测，明确了上海市金山区牛群IBR感染情况，在此基础上可进行针对该病的免疫预防，促进养牛业的健康发展。

1 材料与方法

1.2 病毒毒株牛疱疹病毒、牛副流感病毒、牛布氏杆菌、大肠杆菌由中国农业科学院上海兽医研究所提供。

1.3 主要试剂与仪器TaqMan Universal PCR Master Mix购自Applied Biosystems公司；病毒核酸提取试剂盒（QIAamp viral RNA kit）购自QIAGEN公司；Applied Biosystems 7500型荧光定量PCR仪。

1.4 标准品质粒构建与引物设计以BHV-1 Cooper毒株的全基因组序列（GenBank登录号：KU198480.1），选取其中特异区域序列与pUC57载体连接，构建BHV-1的质粒标准品序列。通过BLAST比对分析，选择保守特异区域设计引物和探针，在1607～1704 bp处设计引物和TaqMan探针，qBHV-gE-1607F: 5'-GTCGCTCTGGGTTCAAA GT-3'，qBHV-gE-1704R: 5'-GCTGCTACCACGGT GTAAT-3'，qBHV-gE probe：5'-FAM -TTGG TTTAGGGACCCGCTTGAAGA-3'-BHQ1。

1.5 荧光定量PCR方法反应体系和条件TaqMan荧光定量PCR扩增反应总体系为20 μL：Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×）10 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.2 μL，DNA模板2 μL，经优化后的上、下游定量引物（10 μmol/L）各0.4 μL，探针（10 μmol/L）0.8 μL，用灭菌ddH2O补足20 μL。优化后的反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，并采集荧光40个循环。

1.6 敏感性试验将1×108copies/μL BHV gE的重组质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度为1×107～1×100copies/μL，作为标准品模板，用于敏感性测试。

1.7 重复性试验以1×106和1×104copies/μL稀释度的pUC-gE质粒标准品作为模板，进行批内重复性试验和批间重复性试验。批内重复性试验是对同一模板同时进行3次重复测定，批间重复性试验是不同时间对同一模板进行3次重复测定，通过批内和批间的Ct值变异系数（标准偏差/重复值平均数）评估方法的重复性。

1.8 特异性试验采用本研究建立的BHV-1 gE TaqMan荧光定量PCR检测方法，分别对牛副流感病毒、牛布氏杆菌、大肠杆菌cDNA或DNA进行检测，评估该方法的特异性。

1.9 临床样品检测选取上海市金山区4家奶牛场，采集鼻腔棉拭子液500份、阴道分泌物100份，样品信息见表1。采用PCR方法对样品进行初检，检测结果呈阳性者，立即采集病牛和同群牛血样和鼻腔棉拭子，利用real-time PCR方法进行复检。

表1 采集的样品信息Table 1 Samples information

2 结果与讨论

2.1 real-time PCR标准曲线将构建的BHV gE质粒标准品进行10倍系列稀释，最终浓度在1×107～1×100copies/μL时的标准曲线见图1，相关系数R2为0.999，线性关系良好。

2.2 敏感性试验结果将BHV gE质粒标准品进行10倍梯度稀释为1×107～1×100copies/μL，以此为模板分别进行常规PCR扩增和荧光定量PCR扩增，Ct值大于35，视为阴性。结果显示，TaqMan荧光定量PCR检测的灵敏度最高可达10 copies/μL。

图1 BHV-1 gE TaqMan荧光定量PCR动力学曲线Fig.1 The dynamic curve of TaqMan real-time qPCR for detection of BHV-1 gE

2.3 重复性试验结果以BHV-1 gE质粒标准品中的1×106和1×104copies/μL 2个稀释度作为模板，对这2个稀释度在不同时间段进行2次重复测定，每次对同一模板同时进行3次重复测定及设置3个重复孔，按照优化的扩增体系和条件进行实时荧光定量PCR。结果表明批内和批间变异系数均小于1%，说明建立的BHV-1 gE荧光定量PCR方法具有较好的重复性，结果稳定可靠（表2）。

2.4 特异性试验结果通过建立的BHV-1 gE TaqMan荧光定量PCR检测方法，分别对牛副流感病毒、牛布氏杆菌、大肠杆菌cDNA或DNA进行检测，结果显示，除标准品有特征性的扩增曲线外，其他病原均没有特征性的扩增曲线（图2），说明建立的荧光定量PCR与其他牛病毒细菌均无交叉反应，特异性强。

表2 BHV-1 gE TaqMan荧光定量PCR检测方法的重复性Table 2 Repeatability of TaqMan real-time qPCR for detection of BHV-1 gE

图2 BHV-1 gE TaqMan荧光定量PCR检测方法的特异性Fig.2 Speci ficity of TaqMan quantitative qPCR for detection of BHV-1 gE

2.5 临床样品检测结果通过TaqMan荧光定量 PCR检测发现，在3家小型奶牛场（金山卫镇奶牛场、上海振华奶牛有限公司、上海忆南奶牛有限公司）采集的鼻腔棉拭子样品中阳性数量均比较少（1%～1.5%），而大型养殖场（光明荷斯坦金山种奶牛场）的阳性率达20%（表3）。采集的阴道棉拭子中，大型养殖场的阳性率高达30%，小型奶牛场的阳性数量在0～5%之间，明显低于大型养殖场。

表3 奶牛样品中的BHV-1的TaqMan荧光定量检测PCR

牛疱疹病毒感染在世界范围内广泛存在，尤其在养牛业比较发达的地区，随着养殖规模的不断扩大，BHV流行趋势愈发严重。BHV-1侵入牛体后，以潜伏感染和持续性感染为主要特点，病牛可终生带毒。该病目前缺乏特效药物，病牛死亡率较高，给养殖业可造成巨大的经济损失。近年来，受国外BHV感染广泛流行的影响，我国从国外引进种牛后，各地陆续报道了BHV-1抗体阳性牛检出的情况。鉴于此病危害较为严重，且分布较广，因而，对该病的发生与流行情况进行普查工作显得十分必要[1-2]。

因为BHV-1可导致持续性感染，免疫并不能有效阻止野毒入侵和繁殖，防治本病的关键措施是对牛群进行定期检疫，控制传染源。家畜传染病的诊断方法有多种，如血清中和试验（SN）、琼脂扩散试验、间接血凝试验、ELISA以及核酸探针检测技术等。这些方法对检测BHV-1起到了重要作用，但同时也存在特异性不强，灵敏度差，耗时长等缺点。随着PCR技术的快速发展，荧光定量PCR方法以周期短、特异性强，灵敏度高等特点成为病毒检测的重点[3-4]。王海军等[5]建立real-time PCR方法扩增BHV-1保守性基因，与本方法反应灵敏度相近，但相比较而言，本研究建立的TaqMan荧光定量PCR比较适用于gE缺失弱毒疫苗使用的感染牛群。

BHV自然感染状态下有一定的潜伏期，一般为3～6 d。BHV可感染各个年龄和品种的牛，但6月龄以上的牛更为易感[1]。家畜感染BHV后，临床表现复杂多样，主要有呼吸道型、生殖道型、脑炎型、结膜炎型。参照基因组序列，本研究选取BHV-1 gE基因设计引物，通过TaqMan探针法Real-time PCR检测发现，3家小型奶牛场采集样品的阳性数量均比较少（在0%～5%），而大型养殖场的阳性率达20%～30%（见表3）。而阴道棉拭子中，大型养殖场的阳性率高达30%，小型奶牛场的阳性数量在0-5%之间，明显低于大型养殖场。这说明呼吸道型、生殖道型均存在，总体上大型奶牛场阳性率高于小型奶牛场。