王 艳，何再平，黄忠荣，张磊萍，王 权，蒋 蔚

（1.上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）为革兰氏阴性菌，通常被称为嗜盐菌[1-2]。VP广泛分布于海水和海底沉积物及鱼、虾、贝类等海产品中，是造成海产品食源性疾病的重要病原菌之一。在中国、日本等许多亚洲国家，美国以及欧洲一些国家，经常发生食用副溶血弧菌感染的海产品引发的食品中毒事件[3]，VP感染已成为全球性严重的公共卫生问题[4-5]。因此建立一种简单、快速、灵敏和特异性较高的检测方法对社会公共卫生安全和水产养殖至关重要。

耐热直接溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH）是副溶血弧菌的重要毒力因子，能够产生溶血毒性。携带TDH的菌株能够在莪萋氏血琼脂培养基上产生β溶血现象即奈川现象。TDH除具备溶血作用外，还具备致死作用及细胞毒性等生物学活性[6-13]。

目前国内外已报道的副溶血弧菌耐热TDH的检测方法主要以KP实验、多重PCR技术、荧光定量PCR检测技术为主，但这些方法需要检测人员具备一定的仪器操作技能，不太适合基层检测。Dot-ELISA检测方法具有操作简单，仪器设备要求低，灵敏度较高等优点。本实验室前期对副溶血弧菌TDH进行了表达、纯化和抗体制备[14]，在此基础上，本研究建立了致病性副溶血弧菌Dot-ELISA方法，并对本实验室保存的部分临床分离株和水产品分离株进行检测，同时与PCR检测方法进行比较，探究Dot-ELISA法的实用性和推广价值。

1 材料与方法

1.1 菌株和血清副溶血弧菌ATCC33847株（TDH阳性菌，TDH+）购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；副溶血弧菌ATCC17802（TDH阴性菌，TDH-）和创伤弧菌ATCC27562购自美国模式培养物集存库；其余副溶血弧菌由本实验室分离和保存；嗜水气单胞菌、大肠杆菌O157和沙门菌为本实验室保存；副溶血弧菌TDH的免疫血清由本实验室研制[14]。

1.2 试剂和耗材蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公司；DNA Marker 购自大连宝生物公司；2×PCR TaqMix 购自广州东盛生物科技有限公司；HRP-羊抗兔IgG 和DAB底物显色液试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；PVDF膜为美国Milipore公司产品；其他试剂为进口或国产分析纯。

1.3 Dot-ELISA方法的操作程序将细菌接种于牛肉汤培养基，37℃、200 r/min培养16～18 h后，取1 mL于离心管中，沸水中煮沸10 min，恢复至室温并混匀。剪取适当大小的PVDF膜，用铅笔画边长为1 cm的方格，在甲醇中浸泡2～5 min，自然风干。取5 μL菌液点于方格中间，37℃烘干。将已点样的PVDF膜浸入脱脂乳中封闭1 h后，用PBST漂洗3次，每次5 min；加入TDH抗血清37℃孵育，用PBST漂洗3次，每次5 min；将膜浸入HRP-羊抗兔IgG中反应，用PBST漂洗3次，每次5 min；将PVDF膜放于干净的平皿中，DAB中避光显色，蒸馏水洗涤终止反应。副溶血弧菌ATCC33847株（TDH+）和ATCC17802（TDH-）分别为阳性和阴性对照，牛肉汤培养基为空白对照。膜上出现明显、规则的棕色斑点者判为阳性，无明显斑点或斑点不清晰者判为阴性，介于两者之间判为可疑。

1.4 Dot-ELISA方法反应条件的优化根据1.3中的操作步骤，对封闭液浓度（含5%、10%和20%脱脂奶的PBST）及封闭时间（30 min、1 h和2 h）、抗体工作浓度（1:50、1:100和1:200）和工作时间（30 min、1 h和2 h）、酶标二抗浓度（1:1000、1:3000、1:5000）和作用时间（30 min、1 h和2 h）进行优化，根据显色结果选择Dot-ELISA方法的最佳方案。

1.5 Dot-ELISA法的特异性试验取副溶血弧菌株（包括TDH 阳性和TDH阴性菌株）以及对照菌（包括创伤弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、沙门菌），分别用副溶血弧菌TDH抗血清进行Dot-ELSIA。

1.6 Dot-ELISA法的敏感性试验将纯化的TDH用50 mmol/L的 Tris-HCL（pH7.5）作10倍梯度稀释，观察出现明显斑点的最高稀释倍数。

1.7 Dot-ELISA法的重复性试验在一批试验内，相同稀释度的样品设立重复组，不同批次之间，对相同样品重复试验，判定重复率。

1.8 Dot-ELISA法与PCR法检测的比较选取本实验室保存的40株副溶血弧菌，用建立的Dot-ELISA方法进行检测。同时采用PCR技术扩增40株副溶血弧菌的耐热溶血素tdh基因，对比两种方法检出的符合率。符合率=（共同阳性数+共同阴性数）/所检菌株总数×100%。PCR方法中所用扩增tdh基因的上游引物P1：5'-CCAGGATCCATG AAACACCAATATTTTGC-3'，下游引物P2：5'-GCAGAGCTCTTATTTTTATTGTTGATGT-3'。特异性扩增的目的片段大小为269 bp。反应体系（25 μL）：Mix 12.5 μL，上下游引物（10 pmol/L）各1 μL，模板1 μL，用ddH2O调整终体积至25 μL。反应条件：94℃预变性2 min；94℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。反应产物于1.0 %琼脂糖凝胶进行电泳试验，15 min后通过紫外成像系统拍摄电泳图。

2 结果

2.1 封闭液及封闭条件的优选结果显示，用20%脱脂乳封闭30 min，背景干净，斑点清晰，重复性好，考虑到封闭是做好该实验的基础，选择20%脱脂乳封闭30 min为最佳封闭条件（图1）。

图1 封闭液及封闭条件的优选Fig.1 Optimization of blocking solution and blocking condition

2.2 抗体工作浓度和作用时间优选结果显示，血清工作浓度在1:50和1:100时斑点比较清晰（图2A和图2B），工作浓度在1:200时斑点相对较淡（图2C）。其中工作浓度为1:50时，反应时间对结果影响不明显，工作浓度在1:100时，反应时间在30 min和1 h时结果明显。因此，选择抗体工作浓度为1:100，反应时间为30 min为最佳条件。

图2 抗体工作浓度和作用时间的优选Fig.2 Optimization of antibody concerntration and reaction time

2.3 酶标二抗工作浓度和作用时间优选如图3所示，二抗工作浓度在1:1000，反应时间为1 h时斑点最清晰。因此选择此条件为最佳酶标二抗反应条件。

2.4 特异性检测特异性的结果显示，只有产TDH阳性副溶血弧菌可以呈现明显清晰地斑点，而不能产生TDH的副溶血弧菌以及其他阴性对照菌均无斑点显示（图4），表明该方法特异性较好。

2.5 灵敏度检测灵敏度检测结果如图5所示，当TDH的浓度为25 μg/mL时，呈现较清晰的斑点，当浓度为2.5 μg/mL时，仅有较浅的斑点显示。所以该方法的检测TDH的灵敏度为25μg /mL。

2.6 重复性试验同一批试验中相同稀释度的样品设立重复组（批内），不同试验日对相同样品进行重复试验（批间），结果重复率均为100 %。

2.7 检测效果比较用Dot-ELISA和PCR检测方法对40株副溶血弧菌的检测结果（图6），二者阴阳性结果的符合率为82.5%（33/40），其中Dot-ELISA方法检出阳性率为72.5%，PCR检测TDH的阳性率为70%。

图3 酶标二抗工作浓度和作用时间优选Fig.3 Optimization of HRP secondary antibody concentration and reaction time

图4 Dot-ELISA特异性的检测Fig.4 Speci ficity test of Dot-ELISA

图5 Dot-ELISA灵敏度的检测Fig.5 Sensitivity test of Dot-ELISA

3 讨论

TDH在副溶血弧菌致病性中起着重要作用，并且在致病性副溶血弧菌不同分离株中高度保守。以TDH作为待检抗原，可以区分致病性和非致病菌副溶血弧菌[15]。目前已有多种TDH检测方法，比较常见的是用PCR检测技术，包括常规PCR、多重PCR和实时荧光定量PCR检测技术。孙宏迪等[16]以副溶血弧菌tdh基因为靶基因设计并合成引物及TaqMan探针，建立副溶血弧菌的实时荧光定量PCR检测方法，该方法灵敏度较高，但所需仪器较昂贵。蒋蔚等[17]建立了副溶血弧菌等的三重PCR法。何再平等[18]建立了致病性副溶血弧菌等的三重PCR检测方法。检测TDH的常规ELISA方法，如刘秀萍等[19]建立的一种基于多个弧菌的融合蛋白TDH-VVCVMHA的双抗体夹心ELISA方法，可用于检测多个弧菌的毒力蛋白。

图6 Dot-ELISA和PCR检测方法比较Fig.6 Comprasion of the detection results between Dot-ELISA and PCR

本研究在先期成功表达TDH重组蛋白并获得免疫血清的基础上，应用抗TDH多抗建立了检测副溶血弧菌TDH的Dot-ELISA检测方法。对40份样品用Dot-ELISA和PCR法同时检测，相符率较高，所建立的Dot-ELISA方法既保留了常规ELISA的优点，又克服了其繁琐的缺点，且结果直观，可用肉眼直接观察，适用于具有TDH的副溶血弧菌的初步筛选，可实现待检菌株的快速有效检测[20]，为开发副溶血弧菌快速诊断试剂盒，防控该病原菌引发的流行疫情提供了科学依据。