魏亚玲， 何 娜， 柏建安， 汤琪云

1.南京医科大学第一附属医院消化内科，江苏 南京 210029； 2.南京医科大学附属逸夫医院消化内科

神经内分泌肿瘤起源于人体弥散神经内分泌系统，好发于消化道的胃、肠道、胰腺部位，称为胃肠胰神经内分泌肿瘤(gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms, GEP-NENs)[1-2]。近些年，GEP-NENs的发病率稳步上升，在消化道肿瘤发病率中仅次于结肠癌居第2位[3]。GEP-NENs患者临床表现常常缺乏特异性，大部分患者确诊时常已处于晚期[4]。目前，GEP-NENs的具体致病机制尚不清楚，临床上也缺乏早期诊断的有效分子标志物[5-6]。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是长度大于200个核苷酸且不具备蛋白质编码能力的RNA分子[7]。与蛋白质编码基因相比，lncRNA表达的组织特异性更高，这提示，lncRNA也许能成为更有效的生物标志物[8]。许多研究[9-11]表明，肿瘤组织中表达异常的lncRNA能参与肿瘤生物学行为的改变。本研究采用人全转录组芯片技术检测胃神经内分泌肿瘤(gastric neuroendocrine neoplasms, G-NENs)组织及癌旁组织中的lncRNA表达谱差异，初步筛选出可能与GEP-NENs致病机制相关的lncRNA肝细胞核因子1 alpha反义链1(hepatocyte nuclear factor 1 alpha-antisense 1, HNF1A-AS1)。旨在分析HNF1A-AS1在G-NENs组织及其相应癌旁组织中的表达情况，探究GEP-NENs肿瘤细胞内部HNF1A-AS1对于肿瘤细胞生物学功能的影响，为临床早期诊断和治疗GEP-NENs提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料收集南京医科大学第一附属医院的3例G-NENs患者的组织样本(由于该肿瘤发病率低，2010年至2015年我们仅收集到3例G-NENs，未获得其他部位满意的G-NENs组织，因此将该3例G-NENs患者均纳入本研究的芯片分析中)。所有G-NENs患者术前均未接受任何局部及全身治疗，术中切除标本送病理科，部分做病理检查，部分置于-80 ℃保存。同时取患者相应癌周正常胃组织并经病理证实为肿瘤阴性的作为对照。GEP-NENs肿瘤细胞系BON-1和LCC-18细胞(美国模式菌种保藏中心)；TRIzol试剂、Essential DNA Green Master(Roche公司，美国)；逆转录试剂盒、G-Flex DNA聚合酶(TaKaRa公司，日本)；Lipofectamine 2000 (Life technologies公司，美国)；结晶紫(碧云天，中国)；Transwell(Millipore公司，美国)；兔抗人β-catenin单克隆抗体、兔抗人E-cadherin单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)。

1.2细胞培养及实验分组BON-1细胞采用含质量浓度为100 g/L的胎牛血清、100 μg/ml 青霉素/链霉素的DMEM/F 12培养基，LCC-18细胞采用含质量浓度为100 g/L的胎牛血清、100 μg/ml 青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度的培养箱中培养。过表达HNF1A-AS1的LCC-18和BON-1细胞作为实验组，转染空质粒的LCC-18和BON-1细胞作为对照组。

1.3质粒构建及细胞转染用于HNF1A-AS1目的片段扩增的引物序列如下：上游:5′-TTAGGTACCAGTAAGTGCAGTAGGTAGGCCAAGA-3′，下游:5′-TTACTCGAGGAGACGGAGTTTCGTTCTTGTTCC-3′。 采用G-Flex DNA聚合酶扩增HNF1A-AS1 DNA 片段。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳获得纯化，接着采用Kpn I和 Xho I对HNF1A-AS1 DNA片段进行双酶切。酶切产物定向连接至表达载体pcDNA3.1的Kpn I 和 Xho I位点之间，从而构建重组质粒pcDNA3.1-HNF1A-AS1。重组质粒转化感受态大肠埃希菌, 随机挑选阳性克隆进行DNA测序分析，鉴定后抽提质粒备用。将传代的LCC-18、BON-1细胞消化接种于6孔板中，当6孔板细胞密度为80%～90%时进行转染，更换为Opti-MEM，配制空质粒或过表达质粒与Lipofectamine 2000、Opti-MEM的混合转染液，静止20 min后加入6孔板中，转染6 h后用完全培养基替换转染液继续培养细胞。

1.4细胞活力检测采用MTT方法检测细胞活力。细胞以每孔5 000个的密度接种于96孔板，在细胞转染后的不同时间点，每孔加入100 μl 5 mg/ml的MTT，37 ℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度的培养箱中孵育4～6 h。每孔加入100 μl质量浓度为200 g/L的SDS以溶解细胞内部形成的甲瓒，37 ℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度的培养箱中孵育20 h后于酶标仪测定各孔在570 nm波长处的吸光度值(OD)。

1.5人全转录组芯片分析采用miRNeasy Mini试剂盒和RNase-Free Dnase Set提取并纯化组织总RNA。根据标准Affymetrix说明书，利用GeneChip®WT PLUS Reagent 试剂盒从250 ng 总RNA中获得生物素化的cDNA。5.5 μg cDNA在标记后于GeneChip®Hybridization Oven 645上45 ℃杂交16 h以进行人全转录组芯片分析。利用Affymetrix Fluidics Station 450对基因芯片进行清洗和染色。最后采用GeneChip®Scanner 3000 7 G 对芯片进行扫描。原始数据通过Robust Multiarray软件分析并完成log2转化。采用火山图筛选具有统计学意义的差异表达lncRNA[12]。本研究的筛选条件为：差异倍数>2且P<0.05。

1.6RNA提取和定量实时PCR(qRT-PCR) 采用TRIzol试剂提取组织和细胞中的总RNA。按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA，以合成的cDNA为模板进行实时PCR反应，GAPDH作为内参照。HNF1A-AS1上游引物:5′-TCAAGAAATGGTGGCTAT-3′，下游引物:5′-GCTCTGAGACTGGCTGAA-3′；GAPDH上游引物:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′，下游引物:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；E-cadherin上游引物:5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′，下游引物:5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′；β-catenin上游引物:5′-AAAGCGGCTGTTAGTCACTGG-3′，下游引物:5′-CGAGTCATTGCATACTGTCCAT-3′。

1.7细胞迁移实验细胞转染48 h后胰酶消化细胞，并用基础培养基重悬，将200 μl含有6×104个细胞的细胞悬液加入Transwell小室上层，将500 μl含质量浓度为100 g/L胎牛血清的完全培养基加入Transwell小室下层。在37 ℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h。将小室置于质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定30 min，质量浓度为10 g/L的结晶紫染色15 min，取出小室并用棉签轻轻擦拭上层未迁移细胞，拍照并计数。

1.8Westernblotting检测细胞转染48 h后，收集细胞，制备SDS-PAGE样品。Western blotting检测LCC-18细胞内E-cadherin、β-catenin的蛋白水平表达变化。配置10%分离胶和5%浓缩胶。等量样品经SDS-PAGE凝胶电泳后，将蛋白转移至甲醇预处理的PVDF膜上(100 V电转2 h)。经质量浓度为50 g/L的脱脂牛奶封闭1 h后，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，次日二抗(1∶5 000)室温孵育2 h。洗涤后加入ECL底物(同体积A和B混合液)室温1 min，最后于暗室显影、定影。

2 结果

2.1HNF1A-AS1在G-NENs组织及其癌旁组织中表达本文采用人全转录组芯片技术获得3例G-NENs组织及其相应癌旁组织的差异lncRNA表达谱。从中筛选差异倍数>2且P<0.05的35个lncRNA作为候选lncRNA。而HNF1A-AS1是这些候选lncRNA中的一员，其在G-NENs组织中的表达水平明显低于癌旁组织(平均差异倍数=2.07，P<0.05，见图1A)。利用qRT-PCR进一步验证芯片结果的可靠性，结果显示，与癌旁组织比较，3例G-NENs组织中HNF1A-AS1的表达水平均明显下降，两两比较差异均有统计学意义(P<0.001，见图1B)。

注：与癌旁组织比较，*P<0.001。

2.2pcDNA3.1-HNF1A-AS1质粒过表达效率检测

pcDNA3.1-HNF1A-AS1过表达质粒和pcDNA3.1空质粒转染肿瘤细胞系LCC-18和BON-1细胞后，过表达组的HNF1A-AS1相对表达量均明显高于转染空质粒组，两两比较差异均有统计学意义(P<0.001，见图2)。

2.3过表达HNF1A-AS1对GEP-NENs细胞增殖的影响与空质粒组相比，LCC-18细胞转染pcDNA3.1-HNF1A-AS1过表达质粒后，OD值明显下降(P<0.05，见图3A)。BON-1细胞转染pcDNA3.1-HNF1A-AS1过表达质粒后，OD值也明显低于空质粒组(P<0.01，见图3B)。

2.4过表达HNF1A-AS1对细胞迁移能力的影响与空质粒组相比，过表达HNF1A-AS1后，LCC-18和BON-1细胞迁移到Transwell小室下层的数目均明显减少，两组之间比较差异均有统计学意义(P<0.001，见图4)。

注：与空质粒组比较，*P<0.001。

2.5过表达HNF1A-AS1对细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)标志物的影响

与空质粒组相比，LCC-18细胞过表达HNF1A-AS1后，间叶细胞标志物β-catenin 的RNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.05，见图5)，而上皮细胞标志物E-cadherin的RNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.01，见图5)。

3 讨论

近年来，GEP-NENs发病率明显升高，但其早期诊断、治疗效果仍不理想，因此对其发病机制的研究显得尤为重要。受益于日渐成熟的全基因组测序和转录本分析技术，发现约66%的人类基因能积极地转录成为RNA，但仅有1%～2%的基因具有蛋白质编码能力[13]。占绝大多数的非编码RNA分子，尤其是lncRNA分子在诸如细胞分化、增殖和凋亡等生物过程中发挥重要作用[14]。研究[9]表明，人类肿瘤细胞的存活和转移与肿瘤组织当中异常的lncRNA水平明显相关。

注：与空质粒组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

注：与空质粒组比较，*P<0.001。

注：与空质粒组比较，*P<0.05，**P<0.01。

目前为止，lncRNA在GEP-NENs中的作用仍未见报道。本研究采用人全转录组芯片技术检测G-NENs组织及其癌旁组织中差异表达的lncRNA，通过初步筛选获得可能与GEP-NENs致病机制有关的lncRNA HNF1A-AS1。HNF1A-AS1是一个长度为2 455个核苷酸的转录本，其基因位于第12号染色体[15]。之前已有多篇文献报道HNF1A-AS1参与人类肿瘤的发生、发展。YANG等[15]发现，HNF1A-AS1可以参与调控食管癌细胞的增殖、细胞周期进展、迁移与侵袭等过程而发挥肿瘤促进作用。但另一些研究[16-17]却发现，HNF1A-AS1在胃癌组织与胰腺癌组织中表达明显下降，这与我们的芯片结果相一致，提示HNF1A-AS1可能是GEP-NENs的潜在致病机制。

本研究发现，与癌旁组织相比，G-NENs组织中HNF1A-AS1显著低表达。体外实验表明，GEP-NENs细胞过表达HNF1A-AS1后，肿瘤细胞的增殖、迁移能力受到明显抑制。此外，上调HNF1A-AS1表达之后，GEP-NENs细胞的上皮细胞标志物E-cadherin表达升高，而间叶细胞标志物β-catenin表达下降，这提示HNF1A-AS1能够抑制GEP-NENs发生EMT。

然而本研究仍存在一定局限性。首先，我们后续应收集更多临床样本，特别是在人肠道和胰腺部位的神经内分泌肿瘤组织中进行HNF1A-AS1的组织水平验证，并进一步分析HNF1A-AS1表达水平与GEP-NENs患者临床病理特征之间的关系；其次，虽然本研究首次探究了HNF1A-AS1对GEP-NENs细胞增殖、迁移的影响，但并未涉及HNF1A-AS1与细胞周期、凋亡等之间的关系，且尚未利用裸鼠成瘤实验进行体内验证。

综上所述，HNF1A-AS1在GEP-NENs组织中表达下调，推测HNF1A-AS1与GEP-NENs的发生、发展有关，有可能成为GEP-NENs的诊断新指标和治疗的新靶点。然而，HNF1A-AS1在GEP-NENs发病中的具体作用机制还不明确，仍待进一步研究。