姜 玲，汤玉蓉，熊文婕，俞 汀，沈小雪，张 灵，林 琳

南京医科大学第一附属医院消化科，江苏 南京 210029

慢性便秘是临床常见病、多发病，大量临床研究[1-2]发现，其存在性别差异，通常女性发病率较男性高，育龄期和妊娠期妇女更易发病。离体肌条实验[3]发现，雌激素可抑制人结肠平滑肌收缩，机制未明。课题组前期实验也证实，17β-雌二醇可抑制大鼠结肠平滑肌收缩[4]。雌激素抑制结肠平滑肌收缩的确切机制尚不明确。

大电导钙激活钾通道(BK)是结肠平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMCs)胞膜上表达最高的钾通道，由α成孔亚基和β1调节亚基组成，在维持SMCs胞膜静息电位、促进细胞复极化中起关键的作用[5]。多项研究[6-9]证实，BK的激活/表达上调参与血管、气管、膀胱、子宫等多部位平滑肌的舒张机制。因此，本研究旨在探讨雌激素(17β-雌二醇)对大鼠结肠平滑肌上BK表达的影响及机制，为治疗雌激素相关性便秘等胃肠动力障碍提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1实验动物和主要试剂清洁级成年雌性SD大鼠，体质量180～200 g；清洁级雌性SD乳鼠，10～12 d龄，由南京医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(苏)2016-000。17β-雌二醇、牛血清白蛋白(BSA)结合的17β-雌二醇(BSA-E2)、雌激素受体阻断剂ICI 182780、雌激素受体α(ERα)选择性激动剂PPT、雌激素受体β(ERβ)选择性激动剂DPN、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)，BKα抗体、BKβ抗体、α-肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体(美国Abcam公司)，β-actin抗体(美国CST公司)，DMEM培养液、青霉素-庆大霉素双抗(美国Hyclone公司)，胎牛血清、Ⅱ型胶原酶(美国Gibco公司)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗、DAPI、BCA蛋白定量试剂盒(中国碧云天公司)，Cy3标记山羊抗兔IgG二抗、FITC标记山羊抗小鼠IgG二抗(美国Bioworld公司)、SuPer ECL化学发光试剂盒(美国Thermo公司)，TaKaRa试剂盒(日本TaKaRa公司)。

1.2实验仪器低温离心机(美国BECKMAN-COMLTER公司)，细胞培养箱(Thermo Forma Series Ⅱ)，激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)，酶标仪(Molecular Devices公司)，蛋白电泳及转膜系统(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像分析系统(GE Healthcare公司)，制冰机BF320 AS(意大利Scotsman公司)。

1.3实验方法

1.3.1 动物分组及干预：成年雌性SD大鼠24只，随机分为以下4组：对照组、E2组、EI组和BSA-E2组。手术去除双侧卵巢，14 d后每组成年大鼠背部皮下埋植30 mm硅胶管(内径2 mm，外径4 mm)，内含不同溶剂[10]。对照组：含溶剂玉米油；E2组：含质量浓度为0.3 g/L的E2，可使血清E2保持在生理浓度(56～92 pg/ml)[10-11]；EI组：含相同浓度的E2(0.3 g/L)和E2抑制剂(ICI 182780)；BSA-E2组：含质量浓度为0.3 g/L的BSA-E2。干预14 d后处理[12]。

1.3.2 组织免疫荧光检测大鼠结肠平滑肌BK分布及表达：取各组结肠平滑肌，OCT包埋，制成冰冻切片。质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定10 min，组化PBS洗3次，每次10 min。质量浓度为100 g/L的山羊血清室温封闭1 h，滴加BKα/BKβ抗体(兔1∶100)和α-SMA抗体(鼠1∶100)，湿盒中4 ℃过夜。PBS洗3次，每次10 min，避光，加Cy3标记山羊抗兔IgG二抗(1∶100)和FITC标记山羊抗小鼠二抗(1∶100)，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次15 min，DAPI染核10 min，PBS洗2次，每次10 min，加抗荧光淬灭剂，封片，荧光显微镜下观察特异性荧光。

1.3.3 Western blotting及qRT-PCR检测结肠平滑肌BK表达：各组取少量大鼠结肠平滑肌组织于1.5 ml EP管中，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。各孔加入约40 μg蛋白样品，以恒压80 V，400 mA行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上，以恒流300 mA，150 V进行转膜，质量浓度为50 g/L的脱脂牛奶封闭2 h，分别加入BKα抗体(兔1∶500)、BKβ抗体(兔1∶500)、β-actin抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，电化学发光显影，凝胶成像系统拍照、分析。以β-actin为内参。

各组取少量大鼠结肠平滑肌组织，在液氮中迅速研磨成小块组织，加入Trizol试剂，匀浆裂解组织，按Trizol试剂说明书提取各组总RNA。按TaKaRa试剂盒说明书，以10 μl体系反转录为cDNA。以获得的cDNA为模板行qRT-PCR扩增。BKα上游引物：5′-ATCACCTGACAACAGCCCAG-3′，下游引物：5′-CAGGACGCTAACGGCAAATG-3′；BKβ上游引物：5′-TAGA-GCTCCAAGGCCTGACT-3′，下游引物：5′-ACAGTCATTTAGTTCCCTGGGT-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。

1.3.4 大鼠结肠SMCs的培养、传代、鉴定：10～12 d龄SD雌性乳鼠，断头处死后，取结肠10 cm，剥除肠管的浆膜和黏膜层，将留下肌层组织剪碎匀浆，离心、消化、重悬细胞，过细胞筛网(100目)，台盼蓝染色确认细胞活力>90%，均匀接种于培养皿，于37 ℃、体积分数95%的O2、5%的CO2的条件下进行原代培养。当细胞长至致密单层时，可进行传代，取2～3代SMCs进行实验。α-SMA标记结肠SMCs，免疫荧光法鉴定[4]。

1.3.5 大鼠结肠SMCs上BK表达：将结肠SMCs上BKα、BKβ分别与α-SMA进行免疫双标，取生长良好的SMCs，消化接种于共聚焦培养皿中，培养箱培养，待SMCs长至单层时，组化PBS冲洗，加质量浓度为40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS冲洗，加质量浓度为100 g/L的山羊血清封闭1 h后，加BKα/BKβ抗体(兔1∶100)和α-SMA一抗(小鼠1∶100)，阴性对照不加一抗，4 ℃过夜；PBS冲洗，避光，加Cy3标记山羊抗兔IgG二抗(1∶100)和FITC标记山羊抗小鼠IgG二抗(1∶100)，37 ℃孵育1 h，PBS冲洗；DAPI染核10 min，PBS冲洗，镜下观察特异性荧光。

1.3.6 大鼠结肠SMCs分组及干预：取对数生长的2～3代SMCs，饥饿12 h后随机分组处理。BSA-E2浓度分组：E2分为0、10、50、100 nmol/L，干预24 h。BSA-E2时间分组：50 nmol/L E2 干预0、6、12、24、48 h。按雌激素最适浓度及时间(50 nmol/L，干预24 h)，分为以下几组：(1)对照组：含2 μl DMSO的DMEM培养液；(2)E2组：含50 nmol/L E2的DMEM培养液；(3)DPN组：含1 μmol/L DPN的DMEM培养液；(4)PPT组：含1 μmol/L PPT的DMEM培养液；(5)EI组：1 μmol/L ICI 182780预处理1 h后，加含50 nmol/L E2的DMEM培养液；(6)BSA-E2组：含50 nmol/L BSA-E2的DMEM培养液。

以上实验均重复3次。DMSO终浓度均不超过1‰。

2 结果

2.1各组大鼠结肠平滑肌组织BK分布及表达免疫荧光双标示：BKα、BKβ(红色)均可与α-SMA(绿色)共表达，DAPI染核后呈蓝色，E2组荧光强度高于对照组、EI组及BSA-E2组(见图1)。

Western blotting及qRT-PCR示：E2组BKα、BKβ蛋白及mRNA表达均高于对照组(BKα：3.98±0.286vs1.09±0.127，5.27±0.554vs1.26±0.077，BKβ：3.47±0.423vs1.12±0.098,4.34±0.409vs1.23±0.057，P均<0.05)，而EI组、BSA-E2组BKα、BKβ蛋白及mRNA表达与对照组比较，差异无统计学意义(BKα：1.33±0.064、1.15±0.049vs1.09±0.127，1.25±0.15、1.13±0.096vs1.26±0.077;BKβ：1.17±0.150、1.23±0.080vs1.12±0.098，1.11±0.077、1.17±0.101vs1.23±0.057，P均>0.05)(见图1)。

注：C：对照组；B：BSA-E2组；E：E2组；I：EI组。与E2组比较，*P<0.05。

2.2大鼠结肠SMCs鉴定及BK表达免疫荧光双标示：结肠SMCs经DAPI染核后呈蓝色，大部分细胞(95%以上)胞质内α-SMA呈绿色荧光,BKα、BKβ均呈阳性(胞膜、胞质内见红色荧光)(见图2)。

2.3不同浓度及不同时间E2对大鼠结肠SMCs上BK表达的影响与0 nmol/L组相比，E2 10、50、100 nmol/L组BKα、BKβ蛋白及mRNA表达均明显升高(BKα：1.86±0.026、6.64±0.053、6.57±0.381vs1.07±0.623，1.87±0.074、7.83±0.675、7.45±0.485vs1.15±0.118，P均<0.05；BKβ：1.94±0.243、6.87±0.042、6.31±0.327vs1.12±0.012，1.89±0.174、8.08±0.381、7.33±0.456vs1.06±0.083，P均<0.05)(见图3A～3B)，100 nmol/L组BK表达较50 nmol/L下降，故50 nmol/L为最合适浓度。

注：免疫荧光双标(400×)。

与0 h组相比，50 nmol/L E2刺激6、12、24、48 h均可上调BK蛋白及mRNA表达(BKα：1.69±0.326、3.56±0.257、6.25±0.137、6.11±0.357vs1.03±0.219，1.75±0.136、3.07±0.437、7.45±0.485、6.24±0.287vs1.15±0.118，P均<0.05；BKβ：2.34±0.167、4.39±0.352、7.65±0.258、7.01±0.339vs1.04±0.153，2.73±0.156、4.20±0.234、7.33±0.456、6.80±0.22vs1.06±0.083，P均<0.05)(见图3C～3D)，刺激48 h后BK表达下降，故24 h为E2作用的最佳时间。

2.4鉴定E2促进BK表达的受体类型E2及雌激素β受体激动剂DPN组可显著上调BK蛋白及mRNA表达(BKα：7.24±0.394、2.37±0.109vs1.05±0.273，7.45±0.485、2.4±0.055vs1.01±0.158，P均<0.05；BKβ：7.28±0.251、2.47±0.184vs1.09±0.149，7.33±0.456、2.22±0.236vs1.06±0.083，P均<0.05)，而雌激素α受体激动剂PPT组、雌激素受体阻断剂ICI 182780组、BSA-E2组与对照组比较，差异无统计学意义(P均>0.05)(见图4)。

图3 E2促进BK表达的最合适浓度及时间 A：E2不同浓度刺激后BK蛋白表达(Western blotting)；B：E2不同浓度刺激后BK mRNA

Fig3EffectsofdifferentconcentrationsandtimethatE2promotedBKexpressionA: expression of BK after stimulation with different concentrations of estradiol (Western blotting); B: expression of BK after stimulation with different concentrations of estradiol (qRT-PCR); C: expression of BK after stimulation with different time of estradiol (Western blotting); D: expression of BK after stimulation with different time of estradiol (qRT-PCR)

注：与对照组、PPT组、ICI组、BSA-E2组比较，*P<0.05。

Fig4IdentificationofreceptortypesthatE2promotedBKexpressionA: expression of BK(Western blotting), β-actin serves as an internal control; B: expression of BK (qRT-PCR)

3 讨论

Ca2+是SMCs收缩的基础，胞内Ca2+浓度升高，Ca2+与钙调蛋白结合,诱发平滑肌收缩蛋白间相互作用而产生收缩[13]。雌激素是否通过钙依赖性途径抑制结肠平滑肌收缩？其机制尚不明确。

BK可表达在结肠SMCs[14-15]，本研究通过免疫荧光也证实，在Ca2+进入SMCs引起兴奋性动作电位后，BK通道参与负反馈机制：增加K+外流、细胞复极甚至超极化致SMCs兴奋性降低、抑制Ca2+内流，使SMC胞内Ca2+浓度下降，促使平滑肌舒张[16]。LI等[17]发现，在小鼠和人神经元细胞系中，E2可上调BK通道各亚基的表达，HU等[18]发现，羊妊娠状态下(雌孕激素增高)，子宫动脉SMCs中BK通道的β1亚基表达显著增加，子宫动脉血管紧张度下降，血流量增加，均与本研究一致。

雌激素与特异性受体结合发挥作用，经典的ER包括ERα、ERβ，近年来发现另一种G蛋白偶联的ER(G protein coupled estrogen receptor，GPER)，多位于细胞膜[19]。本研究发现，雌激素β受体激动剂可上调BK表达，而α受体激动剂、非细胞膜通透的BSA-E2处理后对BK表达无明显影响，提示E2可通过β受体途径促进BK的表达，这与LI等[17]研究结果一致。

本研究只检测了BKα、BKβ的表达，尚需后续检测其通道开放及Ca2+浓度变化。ERβ依赖的BK高表达是否直接介导了E2抑制结肠平滑肌收缩有待进一步研究。