黄卉，何晓萌,2，李来好,3*，杨贤庆，郝淑贤，魏涯，吴燕燕

1(中国水产科学研究院 南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，农业部水产品加工重点实验室，广东 广州，510300)2(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)3(广东省渔业生态环境重点实验室，广东 广州，510300)

鱼糜制品的品质主要由其凝胶特性决定，一般来说凝胶特性好的鱼糜其肌原纤维蛋白含量就高。海水鱼肌原纤维蛋白含量较高，凝胶特性好于淡水鱼，因此鱼糜制品大多采用海水鱼为原料，但其成本较高。随着渔业资源的日益衰退，人们开始关注混合鱼糜制品的经济价值。已有研究[1-3]表明，混合鱼糜制品的凝胶特性高于单一鱼糜制品。罗非鱼是中国南方最主要的淡水养殖品种之一，具有采肉率高，肉质鲜美，弹性良好的特点，随着产量的不断增长，逐渐成为全球关注的淡水养殖鱼类[4-6]。但罗非鱼加工产品形式单一，产品价值没有得到充分开发。而将罗非鱼与海水鱼混合制备鱼糜制品，可以降低成本，得到品质较好的产品，提高罗非鱼的经济价值。同时已有研究表明，不同添加剂对鱼糜的凝胶特性具有增效作用[7-8]，还能改善制品的色香味。文章在罗非鱼-海鲈鱼混合鱼糜的研究基础上[9]，再通过添加剂的增效作用，开发凝胶特性较强、风味好、成本低的罗非鱼混合鱼糜制品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼(Oreochromisniloticus)、海鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)，购于2017年8月(鲜活)，葛根粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、大蒜粉、玉米胚芽油，购于广州客村华润万家超市；海藻糖、山梨醇、面筋蛋白、大豆蛋白、卵清蛋白、牛血清蛋白、卡拉胶、魔芋粉、TGase酶，广州市齐云生物技术有限公司；NaCl、明胶、KCl、NaH2PO4、单宁酸、Na2HPO4、柠檬酸钠、葡萄糖酸钙(溶于沸水)、CaCl2、焦磷酸钠、乙二胺四乙酸二钠、Tris：分析纯，广州化学试剂厂；Triton X-100：分析纯，广州市博理生物科技有限公司；蛋白定量测试盒(考马斯亮蓝法)，南京建成生物工程研究所；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，康为世纪生物科技有限公司。

Ultra Turrax T50均质机，德国IKA公司；Sigma-3K30高速冷冻离心机，德国SIGMA公司；HH-4数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；CT3质构仪，美国Brookfield公司；Powerpac @HV等电聚焦电泳仪，美国Bio-rad公司；Tanon1600凝胶成像系统，上海天能科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼糜加工工艺流程

鱼肉预处理→混合(75%罗非鱼+25%海鲈鱼)→漂洗→脱水→擂溃→加入辅料→灌入肠衣→凝胶化(微波加热)→冷却至4 ℃冷藏过夜→测定样品凝胶特性[9]

1.2.2 凝胶强度的测定

将样品切成25 mm高的圆柱体，采用CT3型质构仪测凝胶强度。测定参数：压缩模式测定鱼糜凝胶的破断强度(g)和凹陷深度(mm)，反映了鱼糜凝胶的硬度和弹性[10]。选用直径5 mm球形探头压缩样品，测试速率1.0 mm/s、下压位移15 mm、触发值 5 g，每次试验做3个平行，取平均值。凝胶强度(g·mm)=破断强度(g)×凹陷深度(mm)

1.2.3 失水率的测定

将样品切成5 mm的薄片并称重(m1)，放于3张滤纸之上，然后用2张滤纸覆盖，用5 kg的重物压制并保持2 min，去掉滤纸，再次称重(m2),按公式(1)计算失水率[11]：

(1)

1.2.4 肌原纤维蛋白的提取

取1 g样品加6倍的A液(pH=7.5，0.1 mol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCI缓冲液)和2倍的B液(1% Triton, pH=7.5，0.1 mol/L KCI，20 mmol/L Tris-HCI缓冲液)，用匀浆机匀浆(50Hz、100 s、3次)，过滤。再用冷冻离心机离心(4 ℃、6 000 r/min、10 min)，去除上清液，将沉淀用8倍的A液混合均匀离心，重复3次。最后用A液将沉淀洗出，即得到盐溶性蛋白溶液[12]，用考马斯亮蓝法测定其浓度。

1.2.5 肌原纤维蛋白SDS-PAGE凝胶电泳

将样品与5×的凝胶上样缓冲液以4∶1的比例混合，煮沸5 min备用。电泳采用5%浓缩胶，10%分离胶，初始电压80 V，当样品进入分离胶后，将电压增大至100 V，当溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝R-250染色[13]，后脱色，在凝胶成像仪上成像。

1.2.6 数据处理

应用Excel及SPSS软件对实验结果进行统计分析，组间分析采用Tukey HSD法进行多重比较，p<0.05为显著，p>0.05为不显著，显著性以a、b、c等字母表示。

2 结果与分析

2.1 淀粉糖类对混合鱼糜凝胶强度和失水率的影响

根据文献与预实验结果分别添加葛根粉8%、马铃薯淀粉6%、木薯淀粉4%、海藻糖8%、山梨醇3%(均为质量分数)[14-16]制备罗非鱼-海鲈鱼混合鱼糜。由图1-A可知，只有添加山梨醇的混合鱼糜的凝胶强度显著高于对照组鱼糜(p<0.05)，达到了2 748.99 g·mm，比对照组提高了6.34%。其他添加剂组鱼糜的凝胶强度都显著低于对照组鱼糜(p<0.05)。添加剂组鱼糜的失水率(图1-B)都显著低于对照组鱼糜的7.68%(p<0.05)，尤其是葛根粉、海藻糖、山梨醇组的失水率降低最显著，分别为1.71%、1.48%、1.67%。实验得出，不同淀粉糖类对鱼糜的凝胶强度和失水率存在显著性影响。吴润锋等[16]研究发现，糖类辅料中，加入3%蔗糖和山梨醇后的鱼糜凝胶强度最高，加入马铃薯淀粉、葛粉草鱼鱼糜的凝胶强度无显著性差异；持水性强于对照组，这是因为不同辅料对水分的水合能力不同，造成了鱼糜凝胶的水结合能力产生差异。因此，山梨醇可作为提高鱼糜凝胶特性的辅料。

图1 淀粉糖类对混合鱼糜凝胶强度(A)和失水率(B)的影响Fig.1 Effect of starch sugar on the gel strength(A) andwater loss rate(B) of mixed surimi注：同一指标中小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。下同。

2.2 蛋白类对混合鱼糜凝胶强度和失水率的影响

根据文献与预实验结果分别添加面筋蛋白3%、大豆蛋白9%、卵清蛋白4%、明胶10%、牛血清蛋白3%[17-19]制备罗非鱼-海鲈鱼混合鱼糜。如图2-A所示，添加大豆蛋白、卵清蛋白、牛血清蛋白的混合鱼糜的凝胶强度显著高于对照组鱼糜(p<0.05)，尤其是卵清蛋白和牛血清蛋白，分别达到了3 404.23 g·mm和3 843.64 g·mm，比对照组分别提高了31.69%和48.68%。其他添加剂组鱼糜的凝胶强度又显著低于对照组鱼糜(p<0.05)。添加大豆蛋白、卵清蛋白、牛血清蛋白的混合鱼糜的失水率(图2-B)显著低于对照组鱼糜的7.68%(p<0.05)，失水率分别为1.2%、2.72%、2.71%。实验得出，不同蛋白类对鱼糜的凝胶强度和失水率存在显著性影响。施珍珍等[19]研究表明，卵清蛋白的最适量为4%，凝胶强度为2 663.7 (g·mm)，比对照组增加了59.7%。因此，卵清蛋白和牛血清蛋白可作为提高鱼糜凝胶特性的辅料。

图2 蛋白类对混合鱼糜凝胶强度(A)和失水率(B)的影响Fig.2 Effect of protein on the gel strength(A) and waterloss rate(B) of mixed surimi

2.3 天然提取物对混合鱼糜凝胶强度和失水率的影响

根据文献与预实验结果分别添加卡拉胶0.8%、魔芋粉2%、大蒜粉1%、单宁酸1%、玉米胚芽油4%[7-8]制备罗非鱼-海鲈鱼混合鱼糜。如图3-A可得，添加单宁酸和卡拉胶的混合鱼糜的凝胶强度显著高于对照组鱼糜(p<0.05)，分别达到了3 251.18 g·mm和3 485.11 g·mm，比对照组分别提高了25.77%和34.82%。其他添加剂组鱼糜的凝胶强度变化不显著。添加单宁酸、魔芋粉、卡拉胶的混合鱼糜的失水率(图3-B)显著低于对照组鱼糜的7.68%(p<0.05)，失水率分别为2.12%、2.33%、2.29%。实验得出，不同天然提取物对鱼糜的凝胶强度和失水率存在显著性影响。邓海萍等[20]通过实验得出，添加卡拉胶能提高鱼糜凝胶的硬度、胶黏性和咀嚼性，添加0.8%的卡拉胶使鱼糜凝胶强度增加了22.37%。因此，单宁酸和卡拉胶可作为提高鱼糜凝胶特性的辅料。

图3 天然提取物对混合鱼糜凝胶强度(A)和失水率(B)的影响Fig.3 Effect of natural extract on the gel strength(A) andwater loss rate(B) of mixed surimi

2.4 盐类化合物对混合鱼糜凝胶强度和失水率的影响

根据文献与预实验结果分别添加柠檬酸钠0.2%、葡萄糖酸钙0.05%、CaCl 0.3%、焦磷酸钠0.2%、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)0.025%(均为质量分数)[21-22]制备罗非鱼-海鲈鱼混合鱼糜。如图4-A可得，添加柠檬酸钠和葡萄糖酸钙的混合鱼糜的凝胶强度显著高于对照组鱼糜(p<0.05)，分别达到了3 167.15 g·mm和2 758.1 g·mm，比对照组分别提高了22.52%和6.69%。其他添加剂组鱼糜的凝胶强度都显著低于对照组鱼糜(p<0.05)。只有添加柠檬酸钠的混合鱼糜的失水率(图4-B)显著低于对照组鱼糜的7.68%(p<0.05)，失水率为1.58%。实验得出，不同盐类化合物对鱼糜的凝胶强度和失水率存在显著性影响。FILOMENA等[22]研究表明，柠檬酸钠可提高罗非鱼鱼糜凝胶的硬度、黏性、弹性、内聚性及回复性。因此，柠檬酸钠可作为提高鱼糜凝胶特性的辅料。

图4 盐类化合物对混合鱼糜凝胶强度(A)和失水率(B)的影响Fig.4 Effect of salt compound on the gel strength(A) andwater loss rate(B) of mixed surimi

2.5 与谷氨酰胺转氨酶(TGase)结合实验

通过实验可知，添加山梨醇、卵清蛋白、牛血清蛋白、单宁酸、卡拉胶、柠檬酸钠、葡萄糖酸钙的罗非鱼-海鲈鱼混合鱼糜的凝胶特性较高，然后分别加入0.025% TGase酶看混合鱼糜的凝胶特性是否有显著提升。通过实验由图5-A可得，添加剂组混合鱼糜的凝胶强度相比于对照组都有显著性提高(p<0.05)，尤其是牛血清蛋白、单宁酸、柠檬酸钠组混合鱼糜的凝胶强度分别达到了4 563.87、4 357.06、3 809.08 g·mm，比对照组分别提高了76.55%、68.55%、47.35%，极大的提高了罗非鱼-海鲈鱼混合鱼糜的凝胶特性。失水率(图5-B)除葡萄糖酸钙组外，其余都显著低于对照组鱼糜的7.33%(p<0.05)。实验得出，TGase酶与添加剂结合对鱼糜的凝胶强度提高更加显著。杨贤庆等[23]研究表明，当同时添加TGase酶和3%的牛血清蛋白时，鸢乌贼鱼糜的凝胶强度最高。

图5 TGase酶加添加剂对混合鱼糜凝胶强度(A)和失水率(B)的影响Fig.5 Effect of TGase with additives on the gel strength(A) and water loss rate(B) of mixed surimi

2.6 SDS-PAGE凝胶电泳实验

肌原纤维蛋白是决定鱼糜制品凝胶特性的关键。肌原纤维蛋白主要包括肌球蛋白重链(MHC)、肌动蛋白(Actin)、原肌球蛋白(TM)等[24]。如下列电泳图所示，SDS-PAGE结果显示混合鱼糜肌原纤维蛋白的MHC分子质量在200 kDa左右、Actin分子质量接近48 kDa、TM分子质量接近35 kDa。不同添加剂对罗非鱼-海鲈鱼混合鱼糜肌原纤维蛋白的自溶有影响，其中对照组、山梨醇、葡萄糖酸钙组鱼糜中MHC和Actin降解较多，这是由于对照组鱼糜中所含的内源性组织蛋白酶容易将MHC和Actin降解[25-26]，而添加剂对鱼糜的内源性组织蛋白酶活性有抑制作用，且不同辅料的抑制效果也不相同。与对照组相比，添加卡拉胶、卵清蛋白、柠檬酸钠、单宁酸、牛血清蛋白的混合鱼糜肌原纤维蛋白的自溶明显受到抑制作用，MHC、Actin和TM条带明显加深，而且添加TG酶组的条带更宽，说明混合鱼糜肌原纤维蛋白交联程度更高，凝胶特性更好。此结论与上述结果一致，说明TG酶结合添加剂能够显著提高混合鱼糜的凝胶特性。

M-标准品Marker；1-对照，2～8：山梨醇、葡萄糖酸钙、卡拉胶、卵清蛋白、柠檬酸钠、单宁酸、牛血清蛋白；9～16分别为1～8+TG酶图6 添加剂和TG酶对混合鱼糜凝胶电泳的影响Fig.6 Effect of additives and TGase on the gel electro-phoresis of mixed surimi

3 结论

通过在罗非鱼-海鲈鱼混合鱼糜中添加淀粉糖类、蛋白类、天然提取物类、盐类化合物，发现添加剂组混合鱼糜的凝胶强度相比于对照组都有显著性提高(p<0.05)，尤其是TGase酶与添加剂结合对混合鱼糜的凝胶强度提高更加显著。

TGase酶加牛血清蛋白、单宁酸、柠檬酸钠组混合鱼糜的凝胶强度分别达到了4 563.87、4 357.06、3 809.08 g·mm，比对照组分别提高了76.55%、68.55%、47.35%；失水率也显著低于对照组鱼糜的7.33%(p<0.05)，分别为1.4%、1.62%、1.36%；而且其电泳中MHC、Actin和TM条带更宽，说明混合鱼糜肌原纤维蛋白交联程度更高，凝胶特性更好。