张惠贤, 童 圆， 胡西洲， 彭立军， 彭西甜*,， 冯钰锜

(1.湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，湖北武汉 430064；2.生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

真菌毒素是产毒霉菌在一定条件下产生的次生代谢产物，研究结果表明一些真菌毒素对动物和人类会造成严重的危害[1 - 2]。黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是谷物、豆类和坚果中最常见的一类真菌毒素，主要有AFT B1、AFT B2、AFT G1、AFT G2等，其中AFT B1的毒性最强，是目前发现的致癌力最强的天然物质[3 - 4]。我国规定AFT B1在谷物及其制品中最大残留限量(MRL)为5～20 μg/kg[5]。近年来，由于全球的气候变暖，谷物被真菌毒素侵害的程度及范围均呈上升趋势。因此，开发简单、准确、灵敏的谷物中AFT B1的检测方法对于保障粮食安全非常重要。

食品中AFT常见分析方法有酶联免疫吸附分析法(ELISA)[6 - 7]、薄层色谱法(TLC)[7 - 8]、胶体金试纸条法[9]、高效液相色谱法(HPLC)[2,4,10 - 12]及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[13 - 15]。ELISA法具有灵敏度高、特异性强、成本低、快捷，且荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰等优点，但是由于其试剂寿命短、需低温保存、假阳性概率较高，主要用于样品的初步筛查；TLC法操作步骤繁琐、重现性不好，常用于AFT的定性分析；LC-MS/MS法选择性好，适合多残留的分析，然而其共洗脱的干扰物会对目标分析物的离子化效率产生影响，影响了分析方法的准确性[16]。目前，高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)是AFT分析最常用的分析方法，该法具有灵敏度高、选择性好，且分析成本较LC-MS/MS低[17]的优点。在荧光检测中，AFT B1分子二呋喃结构中碳碳双键的吸电子诱导效应，使分子荧光减弱，降低了方法灵敏度，而通过化学衍生的方法使双键变为单键可以增强AFT B1的灵敏度，相比于柱前衍生，柱后衍生步骤简单，特别是光化学的柱后衍生，无需使用化学试剂，大大简化了衍生的步骤[18]。

谷物类样品基质复杂，而AFT的浓度较低，因此在仪器分析前使用合适的样品前处理技术是非常必要的。目前，常见的黄曲霉毒素的分离富集有液-液萃取[19 - 20]、固相萃取[2,21]、免疫亲和萃取[22]等方法。本文采用AFT专用固相萃取柱，结合光化学柱后衍生-高效液相色谱-荧光检测法，建立了一种谷物中AFT B1的分析方法。该方法操作简单、稳定性好、灵敏度高，且成本较低，适合谷物中AFT B1的批量分析检测。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

AFT B1标准溶液(10.0 mg/L)，购自农业部环境质量监督检验测试中心(天津)；色谱纯的丙酮、乙腈、正己烷、甲醇，购自德国默克公司；HiCapt Afb AFT专用固相萃取柱(100 mg，3 mL)和HiSep C18-T色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)，购自维泰克科技(武汉)有限公司；其它试剂均为分析纯，超纯水由Milli-Q纯水仪(Millipore,Billerica,MA,USA)制备。

不同的大米和小麦样品购自武汉市内的农贸市场和超市。

1.2 标准储备液的制备

将AFT B1标准溶液(10.0 mg/L)用甲醇配制成200 μg/L的AFT B1标准储备液，4 ℃冰箱避光保存。将AFT B1标准储备液用乙腈∶水(1∶1，V/V)稀释，配制质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的标准系列溶液。

1.3 样品制备

准确称取粉碎均匀的谷物样品2.0 g于50 mL离心管中，加入10 mL超纯水和20 mL乙腈，涡旋混合2 min，超声提取20 min。加入5.0 g NaCl，涡旋混合2 min，于6 000 r/min离心5 min，收集10 mL上清液，减压蒸干，加入2.5 mL二氯甲烷，涡旋1 min，加入2.5 mL正己烷，待净化。

在HiCapt Afb柱(100 mg，3 mL)中依次加入5 mL丙酮、3 mL正己烷-二氯甲烷(1∶1，V/V)活化萃取柱后，加入5 mL待净化液，待上样液完全流出后，用6 mL乙酸乙酯-正己烷(3∶7，V/V)混合溶剂清洗，减压抽干，用8 mL丙酮解吸AFT B1，收集解吸液，40 ℃氮气吹干，1 mL乙腈-水(1∶1，V/V)定容，0.22 μm滤膜过滤至进样瓶中，待上机分析。

1.4 仪器与色谱条件

LC-20A高效液相色谱仪(日本，Shimazu公司)；IKA MS1 Minishake漩涡振荡器(德国，IKA公司)；Anke TDL-40B型离心机(上海安亭仪器厂)；BSA2202S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；OA-SYS氮吹仪(美国，Organomation公司)。色谱工作条件：HiSep C18-T色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)；柱温：40 ℃；流动相：乙腈-水(1∶1，V/V)，0.8 mL/min；荧光检测器：激发波长为384 nm，发射波长为406 nm；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的优化

采用反相的HiSep C18-T柱分离AFT B1，优化了流动相乙腈-水的比例对AFT B1分离的影响，发现当乙腈-水的体积比为1∶1时，AFT B1同样品基质中的干扰物基线分离，并且保留时间较短。

AFT B1遇水荧光易猝灭，影响了分析的灵敏度，需要采用衍生方法加强其荧光信号。目前常用的衍生方法有三种：三氟乙酸衍生法、碘衍生法和光化学柱后衍生法。三氟乙酸柱前衍生法操作繁琐，而柱后碘衍生法需要衍生泵，还需配制衍生溶液。本文使用柱后光化学衍生，只需在色谱柱与检测器之间连接光衍生反应器，使AFT B1与流动相中的水反应，从而在分子中引入给电子基团羟基，大大增加了AFT B1荧光检测的灵敏度，且操作简单，稳定性好[18]。

2.2 样品前处理条件的优化

图1 5.0 μg/L AFT B1标准溶液(a、d)、空白小麦和大米样品(b、e)以及加标5.0 μg/kg的AFT B1的空白小麦和大米样品(c、f)的色谱图Fig.1 Chromatograms of aflatoxin B1 standard solution(a,d),blank wheat and rice samples(b,e) and blank wheat and rice samples with aflatoxin B1 at a 5.0 μg/kg spiked level(c,f)

AFT B1具有一定的极性，本研究采用中等极性的乙腈作为提取溶剂，其在无机盐的作用下易与水相分层，从而除去了样品中水溶性大的干扰物，同时保证了AFT B1的提取回收率在70%以上。样品提取完成后，采用不同比例的正己烷-二氯甲烷溶解AFT B1，固相萃取柱净化。当采用100%的正己烷或者100%的二氯甲烷时，AFT B1的萃取回收率都低于70%。这可能是由于100%的正己烷无法完全溶解AFT B1，而100%的二氯甲烷在固相萃取柱中对AFT B1是一种较强的洗脱溶剂，因此回收率较低。而采用正己烷-二氯甲烷(1∶1，V/V)时，可以较好溶解AFT B1，同时保证后续在固相萃取上样过程中不会将AFT B1洗脱，从而得到较高的回收率。

在最优化的条件下，小麦和大米中AFT B1标样的色谱图、空白色谱图、加标色谱图见图1，从图中可以看出经HiCapt Afb柱萃取净化后，AFT B1的分析没有样品基质的干扰。

2.3 方法学考察

2.3.1线性方程及检出限将制备好的系列标准溶液按优化好的色谱条件分析，平行测定三次，计算峰面积的平均值，以峰面积X对质量浓度Y(μg/kg)作图，得到线性回归方程：Y=4×10-5X-0.2399，AFT B1的质量浓度在0.5～50 μg/kg的范围内线性关系良好(R2=0.9999)。以信噪比的3倍和10倍计算出检出限和定量限，分别为0.03 μg/kg和0.1 μg/kg。我国规定AFT B1在小麦和大米中MRL分别为5.0 μg/kg和10.0 μg/kg，该方法的灵敏度可以满足两种谷物中AFT B1的分析要求。

2.3.2回收率和精密度准确称取2.0 g空白的小麦及大米样品，分别加入1.0、5.0、10.0 μg/kg的AFT B1，按照最优的前处理和色谱条件分析，计算加标回收率，结果见表1。小麦和大米中AFT B1低、中、高三种加标浓度的回收率在78.5%～94.8%之间，日内、日间相对标准偏差(RSD)低于7.2%，表明该方法具有很好的准确度和精密度。

表1 谷物中AFT B1分析的低中高添加回收率和精密度

2.4 实际样品的测定

在武汉市场分别购买了5种不同的小麦和大米样品，在优化的条件下采用本方法对这些样品中的AFT B1进行分析，均未检出AFT B1残留。

3 结论

本文建立了一种谷物中AFT B1的固相萃取-高效液相色谱-荧光检测方法。样品用乙腈水溶液提取、盐析分层、浓缩，黄曲霉毒素专用固相萃取柱净化富集，高效液相色谱-柱后光化学衍生-荧光检测。在最优条件下，谷物中AFT B1在0.5～50 μg/kg线性关系良好，低、中、高三种浓度的添加回收率在78.5%～94.8%之间，日内、日间RSDs低于7.2%，表明该方法具有很好的准确度和精密度。与传统的AFT B1分析方法相比，本文方法操作简便，稳定性好，有机溶剂消耗少，检测成本低。