潘盛 高腾 李蒙

【摘 要】

目的：研究Cleistanthin A（CA）對黑素瘤细胞迁移及β-catenin蛋白的影响。方法：通过划痕实验观察CA对A375细胞迁移活性的影响；通过Western blot实验观察CA对A375细胞中β-catenin蛋白的影响。结果：划痕实验显示：CA对A375细胞的迁移有抑制作用，且有剂量依赖性，且0.1μM这个浓度接近半数迁移抑制率；结合我们前期的实验得知：CA对A375细胞的生长活性有抑制作用，且有剂量依赖性，但低浓度的CA对A375细胞的活性抑制作用与阴性对照组相比虽有统计学意义却不显著[1]，因此选用0.03μM、0.1μM、0.3μM较低浓度组CA进行后面的实验，以降低细胞凋亡对迁移的影响。Western blot实验显示：CA对A375细胞中β-catenin蛋白表达有抑制作用，且有剂量依赖性，0.3μM浓度时与阴性对照组相比有统计学意义。结论 CA可抑制A375细胞的生长活性及迁移且可下调与生长及迁移密切相关的β-catenin蛋白的表达。

【关键词】 CleistanthinA，恶性黑素瘤，迁移，β-catenin

【中图分类号】R715 【文献标志码】

B 【文章编号】1005-0019（2018）16-230-01

Affect of Cleistanthin A on the migration and β-catenin in melanoma cell of A375

Pansheng，gaoteng，limeng

The skin Department，The Seventh People's Hospital ， Changzhou Jiangsu，213003

Abstract Objective：to investigate the effect of Cleistanthin A（CA）treatment on melanoma cell migration and β-catenin. Methods The inhibitory activities of CA on cultured A375 cell migration were detected by Wound-healing assay；Western blot were used to detect the activity of β-catenin. Results Wound-healing assay shows：CA has obvious inhibitory effect to A375 cell migration activity， and in a dose dependent manner， and the concentration of 0.1μM is near the median inhibition rate. Combined with our previous experiments， we learned that： Cell viability is affected significantly by CA. It appears in a dosage manner. But the viability of A375 is not obviously affected by CA in low concentration， So the concentrations of 0.03μM， 0.1μM and 0.3μM of CA are used for further study， in order to reduce the effect of apoptosis on migration. Western blot shows： CA can inhibit the growth activity and migration of A375 cells and down-regulate the expression of beta-catenin protein which is closely related to growth and migration.

Key words：CleistanthinA；melanoma；migration；β-catenin

Cleistanthin A （CA），一种山荷叶素天然糖苷，被证实对肝癌细胞的空泡型H+-ATPase （V-ATPase）的活性有抑制作用，且中和溶酶体的pH值在纳摩尔浓度[2]。关于CA是否能影响黑素瘤细胞A375的PH值我们进行了一些前期实验，并且证实CA可特异性抑制A375细胞的V-ATPase活性，降低细胞质PH、碱化溶酶体酸性，并且抑制A375细胞侵袭及迁移活性[1]。目前Wnt/β-catenin是一条公认与肿瘤相关的信号通路，与肿瘤的发生、发展、侵袭、迁移、凋亡等生物学密切相关[3，4]。并且有实验证实下调β-catenin表达能使人黑色素细胞瘤A375细胞增殖变缓，细胞侵袭、迁移能力下调[5]。因此，我们可以大胆假设Cleistanthin A （CA）是否通过这条通路影响人黑色素细胞瘤A375细胞侵袭及迁移，基于这个假设本研究通过western blot实验证实Cleistanthin A（CA）对β-catenin的影响，从而为其机制的研究做好铺垫。

1 材料与方法

RPMI-1640和小牛血清（FBS）获自Gibco（Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）。青霉素和链霉素从Thermo Fisher Scientific，Inc.获得。Cleistanthin A（CA）由南通大学航海医学研究所（中国南通）合成。巴弗洛霉素A1来自于上海吉玛制药技术有限公司。CA和巴弗洛霉素A1溶于二甲基亚砜（DMSO）中，在-4℃保存直至分析。

A375人黑素瘤細胞由中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所（中国北京）友情提供。 在整个研究中，将细胞在补充有10%FBS和抗生素（100U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素）的RPMI-1640中37℃培养，培养环境为含5%CO2的潮湿空气。

1.1 细胞划痕实验测定。 体外细胞划痕实验测定用于观察CA处理后A375细胞的迁移。 将细胞（1×106个细胞/ ml）接种到6孔板中并孵育24小时。然后用无菌微量移液管尖端刮下细胞单层的中心，以产生恒定宽度的直线间隙。用PBS洗涤孔，并将细胞接种于各种浓度的CA（0，0.003，0.01，0.03，0.1和0.3μM）。 使用倒置光学显微镜（放大倍数，×200）（Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany）在0和24小时对划痕闭合进行成像、测量并统计。

1.2 western blot实验测定。将细胞接种到6cm培养皿中，24小时后达到60-80%融合。加入各种浓度（0，0.03，0.1和0.3μM）和巴弗洛霉素A1（0.1μM）的CA。在24小时，使用含有0.01%蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Fisher Scientific，Inc.）的裂解缓冲液（碧云天生物技术研究所）收集总细胞裂解物，并用超声处理器处理。将细胞裂解物在4℃，10000r/min，转速离心10分钟并收集上清液。用BCA法测定总细胞裂解物的蛋白质浓度。通过10%SDS-PAGE分离蛋白质并电转移到PVDF膜上。将膜在5%脱脂乳中在室温下封闭1小时。随后将封闭好的PVDF膜放入 1：1000 配置好的一抗溶液中4℃过夜，β-catenin 及内参β-actin 分开孵育。TBST清洗3遍，每遍 10min。之后再将PVDF膜放入1：2500配置好的羊抗兔、羊抗鼠 Ig G二抗中室温下孵育1h。TBST清洗3遍，每遍 10min。在暗室中，将现配好的发光液滴加于 PVDF膜之上，用Odyssey CLX Infrared Imaging System扫描PVDF膜，保存荧光条带图。Image J软件分析条带以明确不同细胞中β-catenin 蛋白表达差异。

1.4 统计学方法 每样本进行三次独立重复实验。采用Graphpad Prism 5.0 （Graphpad Software.Inc，San Diego，CA，USA） 统计软件分析处理数据，各组数据以均数±标准差（means ± S.D.）表示。进行单因素方差分析时，显著性差异标准为P<0.05。

2 结果

2.1 CA对A375细胞的生长抑制作用及抑制迁移的药物浓度的确定

我们通过之前的实验得知：CA对A375细胞的生长抑制活性有剂量依赖性，虽与阴性对照组相比有统计学意义，但都未达到IC50值。通过细胞划痕实验探索性地检测CA对A375细胞的迁移活性的影响，结果发现CA处理A375细胞24 h 后，细胞划痕愈合率随药物浓度的增高明显下降，当药物浓度为0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM时细胞划痕愈合率与阴性对照相比差异有统计学意义（P<0.01），CA浓度为0.1μM时接近半数迁移抑制率。根据以上结果我们选择0.03μM、0.1μM、0.3μM这三个浓度为实验浓度组。

2.2 CA对A375细胞中β-catenin蛋白表达水平的影响

培养A375细胞经过不同浓度的CA（0.03μM、0.1μM、0.3μM）以及阳性对照药Bafilomycin A1（0.1μM）处理24 h后，Western blot实验检测细胞内β-catenin蛋白表达，结果我们发现（图2）随着药物浓度的增加，β-catenin的蛋白表达降低。当浓度为0.3μM时，与阴性对照组相比即可出现统计学差异（P<0.05）；相同浓度下与Bafilomycin A1相比无统计学差异。

3 讨论

恶性黑素瘤是皮肤癌中常见的恶性肿瘤之一，恶性程度较高且有年轻化趋势。同时它是一个容易侵袭、转移及复发的肿瘤。目前治疗方法居多，包括手术、放疗、化疗及生物治疗等，但对于它的远期生存率的控制仍然比较局限。因此，寻求一个新的治疗方法有着重要的意义。

CA，作为一种山荷叶素天然糖苷，在对抗MCF-7， HeLa， HepG2， HCT-116， U251 肿瘤细胞株中展现出了强大的抗肿瘤增殖作用[6]。且我们通过实验证实CA作为一种新型的V-ATPase酶抑制剂，可以降低黑素瘤A375细胞V-ATPase酶的活性，抑制细胞内的H+向细胞外转移，从而降低细胞质的PH，升高细胞外的PH，通过这种改变细胞微环境影响A375细胞的侵袭与转移。

近年来，生物信号通路在恶性肿瘤的研究中是一个热点，可能能揭示肿瘤的发生、发展机制。近年来，Vaid Mudit[7]等研究发现，活化β-catenin能促进恶性黑色素瘤细胞的迁移、侵袭，并用β-catenin抑制剂 FH535作用于恶性黑色素瘤，发现FH535能抑制恶性黑色素瘤细胞迁移、侵袭。为了探索CA对A375细胞侵袭及迁移的影响是否与这条通路有关，本研究通过western blot法得出经过CA处理的A375细胞中的β-catenin蛋白的表达有剂量依赖性，且在0.3μM浓度时与阴性对照组相比抑制作用有统计学意义。从而为CA抑制A375细胞迁移的机制研究奠定了一个理论的基础。

参考文献

[1] PAN S， CAI H， GU L， et al. Cleistanthin A inhibits the invasion and metastasis of human melanoma cells by inhibiting the expression of matrix metallopeptidase-2 and

？傆b 9 [J]. Oncology letters， 2017， 14（5）： 6217.

[2] ZHANG Z， MA J， ZHU L， et al. Synthesis and identification of cytotoxic diphyllin glycosides as vacuolar H（+）-ATPase inhibitors [J]. European journal of medicinal chemistry， 2014， 82（466-71.

[3] STOICKCOOPER C L， WEIDINGER G， RIEHLE K J， et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration [J]. Development， 2007， 134（3）： 479.

[4] MENG W， TAKEICHI M. Adherens junction： molecular architecture and regulation [J]. Cold Spring Harb Perspect Biol， 2009， 1（6）： a002899.

[5] 楊跃. β-catenin对恶性黑色素瘤细胞A375的增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响 [D]； 南昌大学医学院 南昌大学， 2014.

[6] ZHANG Z， MA J， ZHU L， et al. Synthesis and identification of cytotoxic diphyllin glycosides as vacuolar H（+）-ATPase inhibitors [J]. European journal of medicinal chemistry， 2014， 82（2）： 466-71.

[7] VAID M， PRASAD R， SUN Q， et al. Silymarin targets β-catenin signaling in blocking migration/invasion of human melanoma cells [J]. PloS one， 2011， 6（7）： e23000.