白宝清,李颖星,金晓弟,范三红*

(山西大学 生命科学学院,山西 太原 030006)

白酒是我国独有的民族文化遗产[1],因其口感典型,千百年来受人们所青睐。清香型白酒的原料主要是高梁等谷物,用中温大曲作为发酵剂,酿酒过程中用到了清蒸清糟酿造工艺、固态地缸发酵等[2-5],清香型白酒中香气成分多样,乙酸乙酯是清香型白酒中主要的香气成分,决定着清香型白酒不同的香味和特性[6-8]。乙缩醛也是白酒中的一种香气成分[9],具有羊乳干酪味,柔和爽口,味甜带涩。

目前,白酒中乙酸乙酯含量检测主要采用气相色谱法(gaschromatography,GC),吴继源[10]采用气相色谱内标法测定白酒中乙酸乙酯含量;黄伟[11]采用内标法与外标法对白酒中乙酸乙酯含量进行比较;谭超等[12]采用红外光谱组合区间偏最小二乘法定量白酒中乙酸乙酯的含量;亓学奎等[13]采用毛细管色谱法测定白酒中的甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯和正丙醇的含量;王延云等[14]采用气相色谱毛细管LZP-930白酒分析专用柱测定白酒中乙酸乙酯含量;熊泽等[15]检测了鄂西地区几种畅销白酒中乙酸乙酯的含量。国内外对乙缩醛在白酒中含量检测的文献很少,黄跃勇等[16]采用气相色谱邻苯二甲酸二壬酯(dinonyl phthalate,DNP)不锈钢填充柱对新蒸白酒中的乙醛与乙缩醛进行检测。

目前有关清香型白酒中乙酸乙酯和乙缩醛的报道较少,尚立成等[17]对气相色谱测定清香型白酒中乙酸乙酯进行了不确定度分析;黄伟[6]对比了内标法与外标法测量清香型白酒中乙酸乙酯含量;史静霞等[18]利用DNP填充柱测定清香型白酒中乙酸乙酯的探讨。白酒中乙酸乙酯和乙缩醛极性相似,即使采用白酒专用色谱柱和高纯氦气作为载气时,也不能将两者完全分离开,而专用色谱柱和高纯氦气价格昂贵[14]。用氮气作为载气在普通毛细管色谱柱上更难以分离,通常会将乙缩醛误认为是乙酸乙酯,从而导致乙酸乙酯的测定结果偏大,而乙缩醛含量则无法测定。

本实验在参考文献[17]的基础上,对白酒样中加酸分解乙缩醛的步骤进行了优化,建立了气相色谱检测白酒中乙酸乙酯和乙缩醛含量的方法,并测定其在6种不同酒精度清香型白酒中的含量。以期为研究清香型白酒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒样(编号为Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6):6种市售清香型白酒(酒精度不同);乙醇标准品(纯度99.9%)、乙酸乙酯标准品(纯度99.9%)、乙缩醛标准品(纯度98.9%)、乙酸正戊酯标准品(纯度99.9%):百灵威(北京)科技有限公司;浓盐酸(纯度36%):国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-2010气相色谱仪:岛津企业管理(中国)有限公司;Vortex-6涡旋混合器:海门市其林贝尔仪器制造有限公司;MYP11-2A恒温磁力搅拌器:上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模拟酒样、标准溶液、标准工作液的配制

模拟酒样:用无水乙醇和蒸馏水配制模拟酒样,酒样中乙醇的体积分数为50%。

标准溶液:准确量取20 mL乙酸乙酯、10 mL乙缩醛、10 mL乙酸正戊酯标准品溶液于容量瓶中,分别用体积分数50%的乙醇溶液定容至100 mL,使乙酸乙酯、乙缩醛、乙酸正戊酯的体积分数分别为20%、10%、10%,4℃存储备用。

标准工作液:分别取0.05～2.00 mL体积分数为10%的乙缩醛标准溶液和体积分数20%的乙酸乙酯标准溶液,1 mL体积分数10%的乙酸正戊酯标准溶液(内标溶液),用体积分数50%的乙醇溶液分别定容至100 mL,使乙酸乙酯和乙缩醛的体积分数分别为0.01%～0.40%和0.005%～0.200%,乙酸正戊酯的体积分数为0.1%,4℃存储备用。

分别取0.05～2.00mL体积分数为10%的乙缩醛标准溶液和20%乙酸乙酯标准溶液,1 mL体积分数为10%的乙酸正戊酯标准溶液(内标溶液),1 mL 36%盐酸溶液,用体积分数50%的乙醇溶液分别定容至100 mL,使乙酸乙酯和乙缩醛的体积分数分别为0.01%～0.40%和0.005%～0.200%,乙酸正戊酯的体积分数为0.1%,4℃存储备用。

1.3.2 色谱条件

色谱柱:SGEAC-20毛细管柱(30m×0.25mm,0.25μm);载气(高纯度N2):1.54mL/min;分流比:50∶1,进样量:1μL,尾吹气:30 mL/min,氢气:40 mL/min,空气:400 mL/min,进样口温度:220℃,检测器温度:220℃,升温程序:起始温度30℃,保持4 min;以5℃/min升温至60℃,保持0 min;以8℃/min升温至180℃,保持1 min,总分析时间26 min。

1.3.3 酒样前处理

取2个10mL的具塞试管,向第一个试管中加入50μL的乙酸正戊酯标准溶液(体积分数为10%),加样品酒至5mL,涡旋振荡混匀后直接GC进样分析;向第2个试管中的酒样中按照50μL的36%的盐酸溶液,加入50μL的乙酸正戊酯标准溶液(体积分数为10%),加样品酒至5 mL,涡旋振荡混匀后放置于30℃恒温水浴中加热30min,然后GC进样分析。

1.3.4 计算方法

2 结果与分析

2.1 酒样前处理方法讨论

2.1.1 盐酸添加量的优化

考察盐酸添加量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)对乙缩醛分解率的影响,结果如图1所不。

图1 盐酸添加量对乙缩醛分解率的影响Fig.1 Effect of hydrochloric acid addition on the decomposition efficiency of acetal

由图1可知,盐酸添加量从0增至2.0%的过程中,溶液中酸度越大,对乙缩醛的分解效果越好。当盐酸添加量为1.0%时,乙缩醛的分解率已达98%,继续增加盐酸添加量,乙缩醛分解效果无明显提高(P＞0.05),过大的酸度可能会促使白酒中的乙酸乙酯发生部分分解,也可能会对毛细管色谱柱产生影响,选择盐酸添加量为1.0%。

2.1.2 水浴温度的优化

考察水浴温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)对乙缩醛分解率的影响,结果如图2所不。

由图2可知,当酸度相同时,水浴温度越高,乙缩醛分解效果越好。当水浴温度由20℃升至40℃时,乙缩醛分解率逐渐增大,水浴温度为30℃时乙缩醛的分解率为98.4%;从30℃升至40℃过程中,随温度的升高,乙缩醛分解率乃有缓慢的提高,考虑到过高的温度可能会使得清香型白酒中的乙酸乙酯挥发,选择水浴温度为30℃。

图2 水浴温度对乙缩醛分解率的影响Fig.2 Effect of water bath temperature on the decomposition efficiency of acetal

2.1.3 水浴时间的优化

考察水浴时间(0、0.5 h、1.0 h、1.5 h)对乙缩醛分解率影响,结果如图3所不。

图3 水浴时间对乙缩醛分解率的影响Fig.3 Effect of water bath time on the decomposition efficiency of acetal

由图3可知,在30℃水浴条件下,随水浴时间的延长乙缩醛的分解率逐渐增大。当水浴时间为0.5 h时,乙缩醛的分解率接近98.6%,当水浴时间从0.5 h延长至1.5 h时,乙缩醛的分解率增加了0.2%,变化较小,考虑到节约时间,选择水浴时间为0.5 h。

2.1.4 最佳酸解乙缩醛条件对乙酸乙酯的影响

考察最佳酸解乙缩醛条件对乙酸乙酯含量损失的影响,结果如图4所不。

图4 水浴时间对乙酸乙酯损失率的影响Fig.4 Effect of water bath time on the loss rate of ethyl acetate

由图4可知,水浴时间从0 h延长至1.5 h时乙酸乙酯损失率从0.2%增至接近0.6%。表明在最佳酸解乙缩醛条件下乙酸乙酯乃有少量的挥发。所以,在乙缩醛最佳酸解条件下对乙酸乙酯含量的测定不会产生明显的影响。

2.2 检出限、定量限和标准曲线的考察结果

按照1.3.1配制乙酸乙酯体积分数为0.02%、0.04%、0.08%、0.10%、0.20%、0.40%和乙缩醛体积分数为0.01%、0.02%、0.04%、0.05%、0.10%、0.20%,内标物乙酸正戊酯的体积分数为0.10%的系列混合标准液各两份,其中一份不加酸,另一份盐酸添加量为1%,分别进行GC分析。未加酸的系列标准溶液测定的是乙缩醛和乙酸乙酯总的峰面积以及内标物乙酸正戊酯的峰面积;加酸的系列标准溶液测定的是乙缩醛酸解后乙酸乙酯的峰面积和内标物乙酸正戊酯的峰面积;乙缩醛和乙酸乙酯总的峰面积减去加酸后乙缩醛酸解后乙酸乙酯的峰面积即为乙缩醛的峰面积。以系列乙酸乙酯和乙缩醛的峰面积分别除以各自内标物乙酸正戊酯的峰面积得峰面积比。体积分数-峰面积比进行线性回归,绘制标准曲线,将信噪比=3确定为检出限(limit of detection,LOD);信噪比=10确定为定量限(limit of quantitation,LOQ),乙酸乙酯和乙缩醛的检出限和定量限如表1所不。

表1 乙酸乙酯和乙缩醛的检出限、定量限、线性范围、相关系数和线性方程Table1 Linear regression equations,linear ranges,coefficients of determination,LOD and LOQ of ethyl acetate and acetal

由表1可知,乙酸乙酯和乙缩醛在各自的体积分数范围内线性关系良好,相关系数R2均＞0.99。

2.3 加标回收率及精密度实验结果

以样品Y-2为加标样,按照2.1确定的最佳条件,使酒样中乙酸乙酯添加体积分数分别为0.04%、0.10%、0.20%,乙缩醛添加体积分数分别为0.02%、0.05%、0.10%,内标物乙酸正戊酯添加浓度体积分数为0.1%的溶液各两份,其中一份盐酸添加量1%,计算对应体积分数浓度的加标回收率和相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)(n=5)。

表2 乙酸乙酯和乙缩醛的加标回收率及精密度实验结果Table2 The adding standard recovery rates and precision of ethyl acetate and acetal

由表2可知,其相对标准偏差(RSD)均≤7.0%,加标回收率为95.2%～105.9%,表明该方法对乙酸乙酯和乙缩醛的检测都有很好的精密度和准确度,能够满足分析的要求。

2.4 实际酒样检测结果分析

对6种不同品牌的清香型白酒中乙酸乙酯和乙缩醛含量进行检测,结果如表3所不。

表3 6种清香型白酒样品的乙酸乙酯和乙缩醛检测结果Table3 Determination results of ethyl acetate and acetal contents in 6 Fen-flavor Baijiu samples g/L

由表3可知,6种清香型白酒中都含有乙酸乙酯和乙缩醛,其中Y-3酒样中乙酸乙酯含量最低,为0.712 g/L,Y-5酒样中乙酸乙酯含量最高,为1.403 g/L;乙缩醛在Y-4酒样中含量最低,为0.132 g/L,Y-6酒样中乙缩醛含量最高,为0.635 g/L。

3 结论

本实验经过优化乙缩醛酸性分解条件,确定盐酸添加量为1.0%,水浴温度为30℃,水浴时间为0.5 h,解决了酒样中乙酸乙酯和乙缩醛由于极性非常相似在普通毛细管色谱柱上难以分离的困难,建立了采用内标法气相色谱对清香型白酒中乙酸乙酯和乙缩醛含量进行检测的方法。实验结果表明,乙酸乙酯和乙缩醛分别在体积分数为0.01%～0.40%和0.005%～0.200%的范围内具有较好的线性关系(R2＞0.99);乙酸乙酯和乙缩醛的检出限分别为0.045 mg/L和0.021 mg/L,定量限0.090 mg/L和0.042 mg/L;加标回收率为95.2%～105.9%。由于不同品牌的清香型白酒酿造工艺有所区别,测得6种清香白酒中乙酸乙酯的含量范围为0.712～1.403 g/L,乙缩醛的含量为0.132～0.635 g/L。