胡用军,刘燕梅,侯 英

(宜宾市产品质量监督检验所,四川 宜宾 644000)

白酒在我国有着悠久历史和文化沉淀。酒中有机酸对酒质有着重要贡献,可作为酯的前驱物质以及起呈味和稳定酒香气的作用[1]。而窖泥作为发酵产酒环境,其中有机酸含量具有重要作用,如窖泥中有机酸含量与窖泥优劣和熟化程度有关联[2-3],进而对酒质产生影响[4]以及作为窖泥质量评价体系的依据之一[5-6]。根据张方等[1]研究,可依据有机酸质量浓度≥10 mg/100 mL的乳酸、乙酸、丁酸、己酸归为一类,且该4种有机酸可占浓香型白酒总酸的90%以上,研究窖泥中该4种有机酸具有重要意义。有机酸含量测定主要采用气相色谱质谱联用仪(gaschromatography-mass spectrometer,GC-MS)[7-8]、气相色谱法(gaschromatography,GC)[9]、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)[10]、离子色谱法(ion chromatography,IC)[11-12]和毛细管电泳法(capillary electrophoresis,CE)[13-14]等方法,其中IC法对无机和有机阴离子具有独特优势,可方便、快速测定酒或窖泥中有机酸含量,较GC-MS法和GC法具有对乳酸直接测定优势,较HPLC法有淋洗液配制简单且不易受pH值变化影响优势,较CE法有仪器在实验室存在的普遍性以至更易进行有机酸测定的优势。

测量不确定度的定义为表征合理地赋予被测量之值的分散性[15],是对测量结果有效性的信心的体现,也是对测量过程的分析,是掌握测量过程关键点的有效途径。参考JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表不》[16]、CNASGL06—2006《化学分析中不确定度的评估指南》中基本流程和文献资料[17-18]来评定离子色谱法对窖泥中乳酸、乙酸、丁酸和己酸4种有机酸含量不确定度,分析了影响窖泥中4种有机酸测量准确性的影响因素,掌握窖泥中4种有机酸含量测量的关键控制点,保障测定结果的准确性,为窖泥中有机酸进一步相关研究提供基础技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸(纯度88.2%):北京坛墨质检科技有限公司;乙酸、丁酸、己酸(纯度均为99.5%):天津市光复精细化工研究所;无水乙醇(分析纯):成都科隆化学品有限公司;实验室用水为赛多利斯超纯水。

1.2 仪器与设备

IC-1100离子色谱仪(配电导检测器(electrical conductivity detector,ECD)和氢氧根自动淋洗发生器):美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备溶液:1 000 mg/L。分别准确称取适量的乳酸、乙酸、丁酸和己酸标准物质,用体积分数为60%乙醇溶液配成1 000 mg/L的标准储备溶液,该溶液冷藏保存。

混合标准工作溶液:分别吸取标准储备溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL和1.0 mL于100 mL容量瓶中,用纯水定容,得到标准工作液质量浓度为0、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L和10 mg/L。现配现用。

1.3.2 样品前处理

①试样制备

取适量鲜窖泥撒在干净、不吸收水分的玻璃板上,充分混匀,装入自封袋中,避光冷藏,备用。

②提取[19]

称取新鲜窖泥25 g于250 mL带盖三角瓶中,加入体积分数为60%的乙醇(100-25×水分%)mL,摇匀。在室温下浸泡1 h,每隔15 min摇动1次。静置,待泥沉降后,用精密滤纸、倾泻法将上层溶液过滤于洁净干燥的50 mL带盖三角瓶中。取滤液1 mL于100 mL容量瓶中,用水稀释定容,经0.45μm滤膜过滤后测定。

1.3.3 离子色谱条件

分离柱AS-11HC+AG11(4 mm×250 mm);流速:1.4 mL/min;柱温:40℃;电子俘获检测器(electron capture detector,ECD)检测器温度:40℃;ASRS 500抑制电流:104 mA;进样体积:10μL。淋洗液梯度程序见表1。

表1 淋洗液梯度程序Table1 Gradient elution program of eluent

1.3.4 数学模型建立

鲜窖泥中4种有机酸含量计算公式[19]如下:

式中:ωi为鲜窖泥中有机酸i含量,mg/100 g;ρi为鲜窖泥浸出液中组分i含量,mg/L;V为浸出液体积,mL;d为浸出液稀释系数;m为鲜窖泥质量,g;10为单位换算系数。

参考CNAS-GL06—2006《化学分析中不确定度的评估指南》中A3.5,将重复性视为相对影响,以重复性系数frep形式引入不确定评定数学模型,得到完整模型计算公式如下:

1.3.5 不确定度来源的识别和分析

根据窖泥测量过程和数学模型可识别出测量过程的不确定度来源:重复性系数frep、浸出液中有机酸含量ρi、浸出液体积V、稀释系数d和鲜窖泥质量m的不确定度。而浸出液中有机酸含量ρi的不确定度又由校准曲线的变动性和配制校准标准溶液的标准溶液浓度所引起的不确定度组成。绘制的因果关系图见图1。

图1 不确定度因果关系Fig.1 Causal relationship of uncertainty

2 结果与分析

2.1 重复性系数frep的不确定度

重复性不确定度包含其他不确定度分量的重复性不确定度,故后面分量不再评定。

对鲜窖泥进行6次独立重复的测量。对每个测量值,采用JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表不》中贝塞尔公式(3)得到其标准偏差s(x),再利用公式(4)计算有机酸含量平均值x¯的标准不确定度u(x¯),重复性系数frep的标准不确定度u(frep)和相对不确定度urel(frep)则由公式(5)、(6)计算得到,结果见表2。

由表2可知,该窖泥有机酸含量中乳酸和己酸相当,其次为乙酸,最低为丁酸。重复性不确定度中乳酸和乙酸相当,丁酸和己酸相当,前者低于或者,但差值较小,大致相当。

表2 重复性试验结果不确定度(n=6)Table2 Uncertainty of repeatability tests results(n=6)

2.2 鲜窖泥浸出液中4种有机酸含量ρi的不确定度

2.2.1 标准溶液的不确定度

4种有机酸标准溶液p的不确定度由纯度Pi、质量mi、体积V的不确定度决定。

(1)纯度Pi的不确定度

乳酸为有证标准物质(certifiedreferencematerial,CRM),纯度为88.2%,相对扩展不确定度为1%(k=2),则乳酸标准物质的标准不确定度为u(P乳酸)=88.2%×0.01/2=0.44%。

乙酸、丁酸、己酸为色谱标准物质,纯度均为99.5%,相对误差均为0.5%。按矩形分布进行换算,乙酸、丁酸、己酸的标准不确定度为u(P乙酸)=u(P丁酸)=u(P己酸)=0.5=0.29%。

(2)质量mi的不确定度

标准物质采用十万分之一的天平称量100 mg,经过查看该天平检定证书,其称量误差为±0.03 mg。天平测量两次(一次空盘调零,一次称样),按照矩形分布,质量mi的标准不确定度为u(m)i=2×0.03=0.035 mg。

(3)体积V的不确定度

标准溶液定容至100 mL容量瓶中。100 mL容量瓶的不确定度来源有两部分:①容量瓶体积的不确定度,100mL容量允差为±0.10 mL[20],按照矩形分布换算成标准不确定度为0.10=0.0577 mL;②容量瓶和溶液的温度与矫正时的温度不同引起的体积不确定度,假设温差为3℃,对水体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1,则置信概率(P=1.96)时体积变化的区间为±100×3×2.1×10-4=±0.063 mL,转换成标准不确定度为0.063/1.96=0.032 1 mL。

以上两项合成得体积V的不确定度为u(V100)==0.58 mL。

2.2.2 校准曲线的不确定度

4种有机酸含量的线性方程见表3,方程采用线性最小二乘法拟合曲线得到。因使用线性最小二乘法拟合曲线程序的前提是假定了横坐标的量的不确定度远小于纵坐标的量的不确定度,所以,浸出液中有机酸含量ρi不确定度计算程序仅仅与峰面积有关,而与校准溶液不确定度无关,也不与从同一溶液中逐次稀释产生必要的相关性。4种有机酸的校准标准溶液的不确定度足够小以至可以忽略。

因此,工作曲线变动性引起4种浸出液中有机酸含量ρi的标准不确定度计算公式为(7)、(8),计算结果见表3。

式中:S为标准曲线的标准差;b为标准曲线斜率;P为试液的测量次数,6;n为标准曲线溶液的测量次数,5;ρ为被测浸出液中有机酸的质量浓度,mg/L;c¯为标准曲线溶液中有机酸质量浓度的平均值,mg/L;ci为标准曲线溶液中有机酸含量质量浓度,mg/L。

表3 浸出液中有机酸含量测定结果的不确定度Table3 Uncertainty of determination results of organic acids content in leach liquid

由表3可知,标准溶液的相对标准不确定度中4种有机酸大致相当,区别仅在标准物质纯度。标准曲线变动性引起的标准不确定度和相对标准不确定度差别均较大,从大到小依次是丁酸、乙酸、乳酸、己酸,其中丁酸的相对不确定度远大于其他3种,这主要由含量差别所导致。

2.3 浸出液体积V的不确定度

2.3.1 鲜窖泥中水分含量不确定度

参考HJ613—2011《土壤干物质和水分的测定重量法》对鲜泥中水分相对偏差要求＜5%[21],则当鲜窖泥中水分含量为37.6%时,绝对差值为1.88%。因乃有2次独立重复的测量要求,按照极差法来评定不确定度,评定公式[16]如下:

通过查找JJG1059.1—2012《测量不确定度评定与表不》中4.3.2.3的表1可知,当n=2时,极差系数C为1.13。故水分测量值的标准不确定度为:

则水分相对不确定度urel(水分)为0.031 3。

2.3.2 乙醇溶液的体积V'的不确定度

加入体积分数为60%乙醇溶液的体积为90.6mL。采用100mL量出式量筒加入90.6mL,由于量筒最小分量为1mL,后面0.6 mL为估读,误差在±0.5 mL。所以量筒不确定度来源有三部分:①估读误差,按照矩形分布换算成标准不确定度为=0.29mL;②量筒体积不确定度,量筒允差为±1.0mL,按照矩形分布换算成标准不确定度为0.577 mL;③量筒和溶液的温度与矫正时的温度不同引起的体积不确定度,假设温差为3℃,对水体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1,则置信概率(P=1.96)时体积变化的区间为±90.6×3×2.1×10-4=±0.057 1 mL,转换成标准偏差为0.057 1/1.96=0.029 1 mL。

2.4 浸出液稀释系数d的不确定度

本实验中,窖泥浸出液稀释了200倍,即d=200。稀释引起的不确定度由0.5 mL分度移液管和100 mL容量瓶的不确定度决定。

(1)0.5 mL分度移液管

0.5 mL分度移液管的标准不确定度主要包括两部分:①分度移液管体积的不确定度,按制造商给定分度移液管允差为误差为±0.010mL,按照均匀分布换算成标准偏差为0.0033 mL;②分度移液管和溶液的温度与校正时的温度不同引起的体积不确定度,假设温差为3℃,对水体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1,则95%置信概率(P=1.96)时体积变化的区间为±0.5×3×2.1×10-4=±0.000 3 mL,转换成标准偏差为0.000 3/1.96=0.000 2 mL。

以上两项合成得出:

(2)100 mL容量瓶不确定度

100 mL容量瓶的不确定度已在2.2.1节进行了评定,直接引用结果。标准不确定度u(V100)=0.58 mL。

因此,稀释系数d的相对不确定度计算公式如下:

2.5 质量m的不确定度

窖泥称量为25 g,采用百分之一的天平,经过查看该天平检定证书,其误差为±0.02 g。天平测量两次(一次空盘调零,一次称样),按照矩形分布,质量m的标准不确定度为u(m)=20.023 g,相对不确定度为ur(elm)=0.023/25=0.000 92。

2.6 合成标准不确定度和扩展不确定度

窖泥中4种有机酸含量的合成标准不确定度计算公式如下:

取扩展因子k=2(近似95%的置信概率),则4种有机酸的扩展不确定度计算公式如下:

表4 不确定度分量一览表Table4 Component list of uncertainty

续表

由表4可知,4种有机酸含量不确定度主要且共同贡献来自重复性和水分含量不确定度,而乙酸和丁酸含量的不确定度贡献还有来自标准曲线变动性不确定度,尤其丁酸的标准曲线变动性不确定度贡献突出,这可能跟所测含量在标准曲线浓度点上位置有一定关系。4种有机酸含量的其他不确定度分量均小于最大不确定度的三分之一,可以忽略。

2.7 分析结果报告

离子色谱测定窖泥中4种有机酸含量的结果为:

ω乳酸=(536±42)mg/100 g,k=2包含概率约95%

ω乙酸=(403±32)mg/100 g,k=2包含概率约95%

ω丁酸=(143±16)mg/100 g,k=2包含概率约95%

ω己酸=(535±42)mg/100 g,k=2包含概率约95%

3 结论

本研究对离子色谱法测定鲜窖泥中4种有机酸含量的不确定度进行了评定。通过评定分析确定影响乳酸和己酸不确定度的主要因素是重复性和水分含量,而影响乙酸和丁酸不确定度的主要因素是重复性、水分含量和标准曲线。这要求鲜窖泥在取样后应注意样品保藏并尽快测定,且在4种有机酸含量测定时,应重点控制重复性和标准曲线误差影响,即需要操作人员水平高,样品均匀性好,仪器性能佳。本研究结果为窖泥中开展有机酸进一步研究提供了基础技术支撑。