刘元，文春南，刘淼，李文，洪利亚，麻兵继

(河南农业大学 农学院 中药材系，河南 郑州 450002)

山药(DioscoreaoppositaThunb)为薯蓣科多年生草质藤本植物薯蓣的根茎[1]。怀山药是指在古怀庆府地区(主要位于今河南焦作境内)种植的山药，因其口味和疗效俱佳，位列“四大怀药”之一，是河南省著名道地药材。研究表明，怀山药含皂苷、黏液质、尿囊素、胆碱、山药碱、淀粉、糖蛋白、多酚氧化酶、VC、氨基酸等成分，还含有硒、铁、铜、锌、锰、钙等多种微量元素[2]。怀山药有健脾、补肺、固肾、抗衰老、抗肿瘤、增强免疫机能、调节内分泌、心肺功能和神经系统等功能[3]，是我国传统的药食两用大宗药材之一。与怀山药相对的是市场上销售的菜山药，菜山药多种植于山东、山西和陕西等地区，虽同为山药，但两者外形上区别很大。怀山药直径一般为1.0～1.5 cm，但菜山药则非常的粗壮，直径能达到4～5 cm，且形状不规则。一般认为，怀山药的药用价值和营养价值要远高于菜山药[4]，但关于怀山药道地品质的形成机制尚不明确。

植物内生菌是指那些在生活史的部分或全部阶段都生活在植物组织活细胞间隙而对植物没有明显伤害的一类微生物。近年来，随着国内外内生菌研究热度的不断提升，中药道地药材内生菌的研究已成为一大热点。研究表明，药用植物内生菌不仅自身能独立产生丰富的次级代谢产物，而且还能参与宿主的代谢过程，对有效成分的产生和积累起到很大的促进作用[5]。王晓龙等[6]从怀山药的根中共分离得到41株内生菌，其中18株细菌，经鉴定为8个属；另有23株真菌，经鉴定为6个属[7]。张建新等[8]从怀山药中分离得到32株内生菌，其中11株内生细菌对白菜软腐菌具有拮抗性。赵龙飞[9]从怀山药中分离得到34株内生菌，其中7株具有明显的抑菌作用。另外，常江川[10]从怀山药中分离得到65株金黄色葡萄球菌、32株大肠埃希菌。

高通量测序技术(high throughput sequencing，HTS)是近年来广泛应用的分子生物学分析方法之一，该测序技术具有高通量、高灵敏度、高准确性和低运行成本的特点，可以深入、细致地研究微生物群落结构，从而克服由于传统菌株分离培养的限制而导致很难获得宿主植物完整内生菌谱的技术障碍，近年来已应用于多个中药材道地性的研究[11]。本实验采用Illumina二代高通量测序技术分别对怀山药和菜山药根茎中的内生细菌16S rDNA V4区域进行扩增和测序，进而对基因序列进行操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)聚类。在此基础上分别对怀山药和菜山药内生细菌的群落组成进行分析，分析和比较两者群落内的组织结构和群落间的差异。在门、纲、目、科、属、种6个水平分析比较了怀山药和菜山药根茎中的内生细菌的群落组成，并从ChaoⅠ、Simpson和Shannon等生态指数和Rank-Abundance曲线方面分析对比了2种来源的山药内生细菌群落内的物种丰富度和均度，为进一步研究怀山药的品质形成提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品

怀山药样本系2016年10月采集于河南省焦作市温县怀山药道地产区，选择10株外观健康的山药植株，取其根茎，放入无菌样品袋中，经河南农业大学中药材系麻兵继教授鉴定为铁棍山药。菜山药系郑州市超市购买。选择2根外观正常的菜山药，放入无菌样品袋中，2组样品均放在4 ℃环境中保存，于12 h内进行表面消毒处理，样品分别命名为Huai和Cai。

1.2 样品表面消毒

将怀山药根茎和菜山药根茎表面用蒸馏水清洗干净，然后用滤纸吸干表面水分。将2组样品放入无菌操作台中，紫外照射40 min，每隔10 min将样品翻转一次，再用75%(体积分数)的乙醇浸泡1～2 min，3%次氯酸钠浸泡2～3 min，75%乙醇清洗30 s，最后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分。第5次冲洗的无菌水用移液枪吸取200 μL，用涂布器在PDA培养基上涂布，作为空白对照(CK)组，每个样本空白组重复3次，观察各个样品CK组有无菌落产生，作为评判样本表面是否消毒彻底的指标[12]。

1.3 样本DNA提取与纯化

使用环境样本DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取后，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

1.4 16S rDNA V4区域的PCR扩增

将提取的DNA进行适当稀释作为模板，把合成的带有Barcode的特异引物对样本的16S rDNA V4区域进行PCR扩增，特异引物序列为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR采用高保真、高效率和高速PCR酶(TOYOBO公司的KOD-Plus-Neo DNA Polymerase)。每个样本进行3次重复，每个PCR反应终止于线性扩增期，PCR结束后将同一样本的PCR产物混合后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN公司)切胶回收PCR产物，TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段，使用2%琼脂糖电泳检测，检测条件为5 V·cm-1，20 min。然后将切胶回收的PCR产物送北京艾普希隆生物科技有限公司进行16S rDNA V4基因的测序分析(使用Illumina公司的MiSeq Reagent Kit v2测序试剂盒)。

1.5 生物信息学分析

测序得到的PE reads首先利用FLASH3进行拼接，同时对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列后，在97%的相似性水平上使用UPARSE算法7进行OTU的聚类，在使用Uchime 8去除嵌合体后，挑选出OTU的代表性序列。使用Greengene 10进行物种分类信息的划分，同时去除注释为叶绿体、线粒体以及非细菌或古菌界的OTU，并使用 FastTree12构建进化树。去除在进化树构建过程中被过滤掉的OTU，然后再使每个样品的OTU具有相同的序列数。基于上述OTU的结果在群落组成(compositional)水平和系统发育(phylogenetic)水平上使用QIIME、Mothur和R等软件对样本进行群落内多样性分析和群落间结构差异的分析。

2 结果与分析

2.1 样本OTU代表序列聚类分析

采用classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平统计各样本的群落组成。图1～3分别表现了怀山药和菜山药内生细菌在门(phylum)、纲(class)和属(genus)水平的群落结构和分类比较结果。从门水平来看，怀山药和菜山药的内生细菌两者均主要分布在厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变性菌门(Proteobacteria)，两者都存在有少量的芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿菌门(Chlorobi)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)和浮霉菌门(Planctomycetes)。值得注意的是，怀山药的内生细菌要比菜山药丰富，放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和装甲菌门(Armatimonadetes)为怀山药的特有真菌门。从纲水平来看，两者内生细菌都主要分布在梭菌纲(Clostridia)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)，但怀山药的细菌群落组成比菜山药的细菌群落组成更加丰富，其中酸微菌纲(Acidimicrobiia)、疣微菌纲(Spartobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidia)和厌氧绳菌纲(Anaerolineae)为怀山药特有菌纲。从属水平来看，怀山药内生细菌主要分布在狭义梭菌属(Clostridiumsensustricto1)、类似牙球菌属(Blastocatella)，而菜山药内生细菌则主要在Clostridiumsensustricto1这一属水平，但在类似牙球菌属中分布较少。另外，两者在杆菌属(Leadbetterella)、木洞菌属(Woodsholea)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土微菌属(Pedomicrobium)和假单胞菌属(Pseudomonas)等都有少量分布。因此，怀山药内生细菌在多个层面上丰富度均大于菜山药。

图1 门水平上2种山药内生细菌的分布

图2 纲水平上2种山药内生细菌的分布

图3 属水平上2种山药内生细菌的比较

图4 门水平上2种山药内生细菌热度图分析

2.2 样本Heatmap热度图分析

Heatmap用于表示一个或多个组的样品在某一分类水平上的群落组成和丰度。丰度用颜色深浅来表征，颜色越偏红，说明丰度越高，越偏蓝色说明丰度越低，群落内既可根据丰度和组成进行聚类，也可按照特定的顺序进行横纵坐标的排列。从图4可知，在门水平上，在怀山药内生细菌主要分布的拟杆菌门(Bacteroidetes)在群落中的比例为31.8%，厚壁菌门(Firmicutes)为24.8%，变性菌门(Proteobacteria)为18.6%。菜山药内生细菌中主要分布为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)分别为38.3%、24.5%。从图4中可以看出怀山药群落组成要比菜山药复杂，且放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、装甲菌门(Armatimonadetes)为怀山药特有菌门。从图5可以看出，怀山药内生细菌在属水平上分别为Bacteroldetes(uncultured)、Proteobacteria(uncultured)、Gemmatimonadetes(uncultured)、Chlorobi(uncultured)、Acidobacteria(uncultured)、Chloroflexi(uncultured)、Firmicutes(uncultured)、Actinobacteria(uncultured)、Lentisphaerae(uncultured)、Armatimonadetes(uncultured)和Planctomycetes(uncultured)，而菜山药分布最多的为Bacteroidetes(uncultured)属。

图5 属水平上2种山药内生细菌热度图分析

2.3 样本进行系统发育分析

系统发育分析能够揭示出生物进化关系的顺序，进而可分析进化历史及其相应的一些机制。系统发育分析的基础是进行进化树的构建，即通过选取某一类基因序列(此样本选取的基因序列是16S rDNA V4区域)进行序列比对，根据序列间的碱基差异和序列特点选取合适的进化模型和构建方法来构建种水平进化树。我们选取丰度最高的50个OTU与NCBI数据库中基因序列进行比对，采用最大似然法构建发育树(图6)。从图6可知，狭义梭菌Clostridiumsensustricto1在怀山药和菜山药分布均最多，丰度分别为75、130。怀山药的特有菌有鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)、Variibactersp.、Planctomycessp.、Phreatobactersp.、Chthoniobactersp.、Arenimonassp.和假单胞菌(Pseudomonassp.)，而菜山药中的特有菌为Burkholderiasp.、Rhodoplanessp.和Filimonassp.，在两者中OTU丰度都很小，与上述分类分析的结果相吻合。

图6 怀山药和菜山药内生细菌系统发育树比较

2.4 样本alpha多样性分析

在群落生态学的研究中，物种多样性包括了alpha-多样性(群落内)、beta-多样性(群落间)和gamma-多样性(区域总多样性)。通过样本的alpha-多样性分析可以反映微生物群落的物种丰度(Richness)和均匀性(Evenness)。alpha多样性分析的分析指数有ChaoⅠ(估算物种丰富度)、Shannon(估算样本中微生物多样性)和Faith’s PD(估算物种丰富度)。分析指数结果如图7所示。综合三项指数分析可知，怀山药内生细菌群落多样性要高于菜山药。

Observed代表观测到的OTU数目，可用来和其他多样性指标进行比较图7 2种山药内生细菌Alpha多样性比较

Rank-Abundance曲线可用来解释多样性的2个方面，即物种多度和物种均匀度。构建方法是统计单一样本中的每一个OTU所含的序列数，将OTU按丰度由大到小等级排序，再以OTU等级为横坐标，以累积的序列丰度为纵坐标做图。在水平方向，物种的多度由曲线的宽度来反映，曲线在横轴上的范围越大，物种的丰富度越高；曲线的形状(平滑程度)反映了样本中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀。由图8可知，怀山药的内生细菌要比菜山药丰富，种群分布更加均匀，由于两者的曲线都有较大斜率的变化，故两者中都分布有优势菌群。

图8 2种山药内生细菌Rank-Abundance曲线比较

3 讨论

本实验首次利用高通量测序技术对怀山药和菜山药根茎内环境中的细菌群落进行对比分析。实验结果表明，怀山药根茎内生菌的物种丰富度要高于菜山药，且怀山药内生菌分布更加均匀。在纲水平上怀山药根茎中分布最多的为拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌，所占比例为31.8%，其次为厚壁菌门(Firmicutes)细菌，所占比例为24.8%；而在菜山药根茎中分布最多的为厚壁菌门(Firmicutes，38.3%)，其次为拟杆菌门(Bacteroidetes，24.5%)。怀山药根茎中的特有菌门为Actinobacteria(2%)、Verrucomicrobia(0.6%)和Armatimonadetes(0.3%)。在属水平上，两者中分布最多的均为Clostridiumsensustricto1菌属，在怀山药和菜山药中都存在Blastocatella、Leadbetterella、Woodsholea木洞菌属、Acinetobacter不动杆菌属、Pedomicrobium土微菌属、Pseudomonas等7种菌属细菌。经比较分析确定革兰氏阴性棒状杆菌(Sphingomonassp.)、Variibactersp.、浮霉状菌(Planctomycessp.)、Phreatobactersp.、Chthoniobactersp.、Arenimonassp.、假单胞菌(Pseudomonassp.)为怀山药的特有菌，而菜山药中的特有菌为Burkholderiasp.、Rhodoplanessp.和Filimonassp.。本文首次比较系统地对怀山药和菜山药内生细菌的分布情况进行对比分析，为怀山药道地性研究提供了一定的基础。