李施蒙

（西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏 拉萨 850000）

目前，重金属污染已经成为亟待解决的世界性难题，环境中的重金属如Pd、Cr等可通过食物链的传递和富集，最终在人体中累积，破坏正常的生理代谢活动，从而危害人体健康［1］。重金属镉（Cadmium, Cd）是天然存在于自然环境中具有极高生物毒性的重金属元素之一，随着工业化、城镇化的迅速发展，我国土壤环境的Cd含量超标状况日趋严重［2］。重金属镉离子进入细胞需要相应的转运蛋白或者离子通道，但镉不是植物必需的矿质营养元素，因此植物根部对镉离子的吸收主要依靠Zn、Fe、Mn等与其化学结构相似必需元素的转运蛋白或通道［3］。对于植物的生长而言，Zn是不可或缺的矿质营养元素，金属耐受蛋白MTP1（Metal tolerance protein 1）作为一种跨膜蛋白在植物锌离子转运过程中起着重要作用。在十字花科植物拟南芥［4］中最先报道的阳离子转运蛋白（CDF）家族成员MTP1，主要参与锌离子向细胞外的转运［5］。

研究发现，CDF家族广泛存在于细菌、酵母、拟南芥等原核和真核生物中，主要定位于膜体如细菌的细胞膜、植物和酵母的液泡膜以及哺乳动物的高尔基体等膜上［6-7］，具有6个跨膜结构域（Transmembrane domain，TMD）［8］。植物中，拟南芥的AtMTP1基因是研究最透彻的CDF家族蛋白［9］，MTP1蛋白能将锌离子从细胞质转移到液泡。随后萝卜［10］和水稻［11］中的MTP1基因也相继被克隆，烟草过表达NtMTP1基因后植株对锌胁迫的耐受性显著增强［12］。

目前芸薹属中甘蓝型油菜耐镉胁迫的研究［13-14］已有报道，但对MTP1基因的研究却较少。本研究根据芸薹属AC基因组作物的亲缘物种拟南芥的MTP1基因序列作为基序，在白菜（Brassica rapa）［15］、甘蓝（B.oleracea）［16］、甘蓝型油菜（B.napus）［17］3个物种的全基因组数据库中筛选和鉴定芸薹属AC基因组MTP1基因，并从系统进化、基因结构、蛋白理化性质、亚细胞定位和基因组织表达特异性等方面进行分析，旨在为进一步研究芸薹属作物中MTP1基因参与锌离子转运机制奠定基础，促进低积累重金属芸薹属作物的种质创新和品种改良。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在拟南芥基因组数据库（http://www.arabidopsis.org/）中检索并下载拟南芥MTP1基因的CDS序列。以拟南芥MTP1基因的CDS序列为基序利用芸薹属数据库（http://brassicadb.org/brad/），分别在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组CDS数据库中进行Blastn搜索（值为1e-100），同时利用在线软件SMART对下载的拟南芥MTP1蛋白序列和Blast检索得到的白菜、甘蓝和甘蓝型油菜MTP1候选基因的蛋白序列进行结构域分析，结合CDF蛋白家族MTP1蛋白序列的结构域特点进一步鉴定芸薹属AC基因组中的MTP1候选基因。

1.2 理化性质及亚细胞定位分析

利用在线分析软件ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）［18］分析芸薹属 AC基因组中的MTP1基因和拟南芥MTP1基因编码蛋白的理化性质，包括分子量（Molecular Weight）、理论等电点（Theoretical pI）、不稳定系数（Instability index）和亲疏水性（Grand average of hydropathicity, GRAVY）等。利用软件Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）对上述MTP1基因编码的蛋白进行亚细胞定位预测。

1.3 蛋白质二级结构、跨膜结构域、磷酸化位点预测及系统进化分析

利用软件TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行蛋白质跨膜结构域分析。利用在线分析软件Sopma Secondary Structure Prediction Method（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=npsa_sopma.html）对MTP1基因的蛋白质进行二级结构预测。利用 NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）对蛋白质的磷酸化位点进行预测。利用软件MEGA5.2的邻近法（neighbor-joining,NJ）［19］，对芸薹属AC基因组中MTP1蛋白进行系统进化分析，采用p-distance模型，并设置Bootstrap值为1 000进行校正，构建系统进化树。

1.4 甘蓝型油菜BnMTP1不同组织部位的表达模式分析

使用甘蓝型油菜栽培种中双11的转录组数据［20］，提取BnMTP1基因在根、茎、叶、蕾、花和种子等组织部位的表达量FPKM值，比较分析其表达模式。

2 结果与分析

2.1 芸薹属AC基因组中MTP1基因家族的鉴定

本研究利用拟南芥AtMTP1基因的CDS序列，通过芸薹属数据库对白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组CDS序列进行Blastn同源比对。由于CDF家族中MTP1蛋白含有6个跨膜结构域，对获得的同源序列再使用SMART软件进一步鉴定。结果（表1）表明，在白菜基因组中获得1条序列，位于A03染色体上，命名为BrMTP1A03（Bra000432）；在甘蓝基因组中获得3条序列，均位于C04染色体上，分别命名为BolMTP1-1（Bol004901）、BolMTP1-2（Bol014388） 和BolMTP1-3（Bol021804）。在甘蓝型油菜A亚基因组中获得3条序列，分别位于A03、A04和A05染色体上，命名为BnMTP1A03（BnaA03g21530D）、BnMTP1A04（BnaA04g26760D）和BnMTP1A05（BnaA05g01080D）；在C亚基因组中获得1条序列，位于C04染色体上，命名为BnMTP1C04（BnaC04g00620D）。这些基因编码序列（coding sequence, CDS）长度为 990～1 437 bp，除BnMTP1A04含有4个外显子外，芸薹属AC基因组中的其他MTP1基因均只含有1个外显子。

表1 芸薹属AC基因组MTP1基因的相关信息

2.2 MTP1蛋白的理化性质及亚细胞定位

利用软件Plant-mPLoc对芸薹属AC基因组中鉴定的MTP1蛋白进行亚细胞定位分析，结果发现该蛋白均定位于液泡，结合拟南芥AtMTP1蛋白定位于液泡膜，故推测这些MTP1蛋白也属于液泡跨膜转运蛋白，助其行使金属锌离子的跨膜转运。

使用ProtParam在线分析工具对MTP1蛋白进行理化性质分析，结果（表2）表明，芸薹属AC基因组中的MTP1蛋白均包含20种常见氨基酸，均不含有硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸。蛋白序列长度最短的为329 aa（BnMTP1C04和BolMTP1-1），最长的为478 aa（BnMTP1A04）；分子量最小的为36.59 749 ku（BolMTP1-1），最大为53.07 049 ku（BnMTP1A04）；等电点（pI）最低为5.69（BnMTP1A05和BolMTP1-2），最高为7.03（BnMTP1A04）；稳定性系数最小为32.93（BolMTP1-1），最大为42.23（BnMTP1A04），除BnMTP1A04外均为稳定蛋白（＜40）；脂肪族氨基酸系数最小为106.46（BnMTP1A04），最大为121.73（BnMTP1C04和BolMTP1-1）；带负电荷氨基酸残基数（Asp/Glu）和带正电荷氨基酸残基数（Arg/Lys）最小值分别为37、22（BnMTP1C04和BolMTP1-1），最大值为47、45（BnMTP1C04和BolMTP1-1）。

亲疏水性分析发现肽链总体均表现为疏水性（正值），疏水性系数最小为0.091（BnMTP1A04），最大为0.359（BolMTP1-1），可见这些MTP1蛋白均表现为疏水性，不是水溶性蛋白，这与其属于膜蛋白的特性相吻合。

表2 芸薹属AC基因组MTP1蛋白的理化性质

2.3 芸薹属AC基因组中MTP1基因进化分析及蛋白结构预测

蛋白质的二级结构是连接一级和高级结构的重要纽带和桥梁，它为高级结构分析奠定了基础［21］。使用在线分析软件SOPMA对MTP1蛋白的二级结构进行分析，发现MTP1蛋白主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角等4种结构组成（表3），α-螺旋为主要结构元件，占比接近50%，其次是无规则卷曲和延伸链，β-转角最少。CDF家族中MTP转运蛋白拥有多个跨膜结构域，其二级结构主要由α-螺旋组成，预测结果符合MTP1转运蛋白的基本结构特征。

表3 MTP1蛋白二级结构预测

2.4 MTP1蛋白跨膜结构域和磷酸化位点分析

利用HMHMM Server软件对MTP1蛋白进行跨膜结构域分析，结果（表4）表明，这些蛋白的典型结构特征具有6个跨膜结构域（TM1～TM6）。拟南芥的AtMTP1蛋白第一跨膜区在前60 aa区间内，芸薹属AC基因组的MTP1蛋白中，BnMTP1C04、BolMTP1-1和BolMTP1-2的第一跨膜区均在前60 aa区间内，除了BnMTP1A04外，所有MTP1蛋白的第一跨膜区均是从前60 aa区间开始，BnMTP1A04从155号氨基酸残基开始。MTP1蛋白的6个跨膜结构域中，前4个跨膜域连续串联分布，后2个跨膜域连续串联分布，在第四和第五跨膜区之间有一个长环。

蛋白质磷酸化是生物体内普遍存在的一种重要活性调节机制。使用NetPhos 3.1软件对芸薹属AC基因组中MTP1蛋白的磷酸化位点进行分析，结果（表5）发现白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的MTP1均具有多种不同的磷酸化位点，其中，丝氨酸磷酸化位点（Ser）最多为25个（BnMTP1A04），最少为11个（BnMTP1C04、BolMTP1-1）；苏氨酸磷酸化位点（Thr）最多为14个（BnMTP1A04、BnMTP1A05），最少为7个（BolMTP1-2）；酪氨酸磷酸化位点（Tyr）只在甘蓝BolMTP1-2中具有1个，其他MTP1蛋白均不具有酪氨酸磷酸化位点。说明MTP1蛋白的磷酸化主要以丝氨酸和苏氨酸磷酸化为主。

表4 MTP1蛋白跨膜结构域预测

表5 MTP1蛋白的磷酸化位点分析

2.5 MTP1蛋白系统进化分析

使用MEGA5.2软件的NJ法构建芸薹属AC基因组MTP1的系统发育树，结果（图1）表明，甘蓝型油菜BnMTP1A03与白菜BrMTP1A03、BnMTP1C04与 甘 蓝BolMTP1-1、BnMTP1A04与BolMTP1-3分别聚类在同一个分支上，说明其遗传距离最近；BnMTP1C04、BolMTP1-1又与BnMTP1A05聚类在一个分支上，说明其遗传距离较近；而AtMTP1和BolMTP1-2分别在单独一个分支上。根据氨基酸构建的系统进化树，也反映其同源进化的亲缘关系，甘蓝型油菜A亚基因组的BnMTP1A03与白菜A基因组的BrMTP1A03亲缘关系最近；甘蓝型油菜C亚基因组的BnMTP1C04与甘蓝C基因组的BolMTP1-1亲缘关系最近，同时与甘蓝型油菜A亚基因组的BnMTP1A05亲缘关系较近；而甘蓝型油菜A亚基因组的BnMTP1A04与甘蓝C基因组的BolMTP1-3亲缘关系最近，说明甘蓝型油菜在继承白菜和甘蓝基因组的同时，不同亚基因组之间发生融合重组事件。

图1 芸薹属AC基因组MTP1蛋白的系统进化树

2.6 甘蓝型油菜BnMTP1基因不同组织部位表达模式分析

为了进一步从基因表达水平上研究MTP1基因的表达模式，利用已发表的甘蓝型油菜栽培种中双11的转录组数据，分别提取根、茎杆、幼叶、成熟叶、花蕾和花后10 d、21 d、30 d种子中BnMTP1基因表达量的FPKM值进行比较分析。如图2所示，在甘蓝型油菜中MTP1基因在不同组织部位中均有表达，BnMTP1A03和BnMTP1A05在花蕾中的表达量最高，而BnMTP1A04和BnMTP1C04在花后10 d种子中的表达量最高；BnMTP1A04和BnMTP1A05在根中的表达量最低，BnMTP1A03和BnMTP1C04在花后30 d种子中的表达量最低。甘蓝型油菜中4个BnMTP1同源基因的表达水平也存在明显差异，BnMTP1A04表达水平相对最高，明显高于其他3个基因，BnMTP1A03的表达水平相对最低。

图2 油菜BnMTP1基因表达模式分析

3 结论与讨论

近年来有关植物重金属跨膜转运载体的研究取得重要进展［22］，如HMA、ABCA、CAX等转运金属离子跨膜运载蛋白的基因已有报道，根据其位于不同组织细胞和不同细胞器，分为金属离子输入蛋白（Metal uptake protein）和金属离子输出蛋白（Metal efflux protein），分别介导金属离子进入和泵出胞质。而且这些基因的过量表达对金属在细胞中的运输、分布和富集及提高植物的抗性方面发挥了重要作用［23］。目前研究较为深入的主要有CDF家族［24］、ZIP（Zinc-Iron Regulated Transproter Proteins）家 族、Nramp（Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins）家族、重金属ATP酶（HMAs）、ABC（ATP-Binding Cassette）转运蛋白以及金属阳离子/H+反向运输器等［25-26］。本研究旨在从生物信息学层面解析芸薹属AC基因组中CDF家族成员MTP1基因和蛋白的特性，为后续研究其分子功能奠定基础。

MTP1蛋白在植物中普遍存在，且仍不断有新的CDF家族蛋白被鉴定［27］，对其研究也不断深入，但MTP1蛋白的结构和功能机制还有较多未知，有待进一步研究。结构上MTP1蛋白的三维结构分析仍然处于使用模型分析软件进行推测阶段，杨树中负责转运锌离子的PtMTP蛋白在体外形成一个寡聚同系物［28］，其可被二硫苏糖醇破坏，说明二硫键可能在其形成过程中起到一定作用，MTP蛋白很可能是以同型二聚体的形式存在并发挥功能。本研究通过比对芸薹属白菜、甘蓝和甘蓝型油菜等物种的基因组，在AC基因组中共鉴定到8个MTP1基因，并对其蛋白质一级、二级结构进行分析，发现这些MTP1蛋白含有20种常见氨基酸，二级结构以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链为主，跨膜结构域预测发现均含有6个跨膜结构域，与已有文献报道一致，属于膜蛋白。功能上MTP1蛋白不仅有转运金属离子的作用，在抵抗重金属胁迫过程也扮演重要角色，用于解除过度积累的金属对生物的毒性，还可能用于促进离子传递的信号转导［29］。对芸薹属AC基因组MTP1蛋白进行理化性质分析，发现均为稳定性蛋白，表现为疏水性，这与其属于膜蛋白的特性相吻合，利于执行转运金属离子的功能。

拟南芥AtMTP1 基因［30］和苜蓿MtMTP1［31］基因主要在幼嫩的叶片中表达，水稻OsMTP1基因［33］主要在成熟老叶和茎中表达，烟草NtMTP1基因［12］则主要在花和叶片中表达，根、茎和种子中的表达量较低。本研究中甘蓝型油菜BnMTP1基因在花蕾和花后10 d种子中的表达量较高，根和茎的表达量最低，其次是叶片。甘蓝型油菜BnMTP1基因在不同的组织部位中均有表达，地上部分的表达高于根部的表达，说明地上部分的金属离子转运更活跃。这些结果为进一步研究芸薹属植物MTP1转运蛋白的功能和转运机制奠定基础，目前甘蓝型油菜BnMTP1转运蛋白的研究较少，若通过基因工程等分子技术实现甘蓝型油菜对重金属镉的富集，将推进新用途油菜的开发利用，为重金属污染的生态修复提供帮助。