刘畅，李桂玲



细菌外膜囊泡的研究及其在医药生物技术领域的应用进展

刘畅，李桂玲

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所制剂室

细菌外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）是由革兰阴性细菌以出芽的方式分离出来的直径为 20 ~ 300 nm 的球形双层纳米结构。细菌产生的膜囊泡保留了源细菌的理化特性，但不能再生和复制。

在最初发现的几十年里，人们一直认为 OMVs 是细菌生长的产物，然而后来证实它是原核细胞有目的产生的纳米结构。OMVs 的生物起源有多种机制，其生物起源伴随着内含物特异性富集和包被，是一个精细的、有选择的过程，而不是随机分泌的[1]。OMVs 从细菌分离后不影响细胞膜的完整性[2]。OMVs 在发病机制、细胞通讯、基因转移等方面具有重要作用。比如，OMVs 可作为毒力因子的载体，使宿主感染细菌发病，并且 OMVs 可作为一种新型载体，通过递送药物达到治疗癌症或其他疾病的目的[3]。

本文将综述 OMVs 近年来的研究进展，包括 OMVs 的研究概况、结构和成分、提取与纯化、生物产生机制、免疫调节和发病机制及其应用等。期望本文有助于增进对 OMVs 生物学的了解，并为 OMVs 在医药及各种生物技术中的应用提供新思路。

1 研究概况

近 50 年前，有研究报道了一个专性厌氧肠杆菌周围 OMVs 样结构的透射电镜（TEM）照片[4]。随后，首次报道了大肠杆菌赖氨酸突变体在缺少赖氨酸的培养基中，发现其表面有许多气泡[5]。此后，越来越多的文献描述了各种革兰阴性细菌分泌类似 OMVs 的结构[6-10]。至此，由这类细菌分泌 OMVs 被认为是一种常见现象[11-12]。革兰阳性细菌的单层膜结构使研究者起初认为 OMVs 只产生于革兰阴性细菌，但革兰阳性细菌和阴性细菌相似的程度，又让研究者猜想革兰阳性细菌会不会同样产生 OMVs。随着研究进展，发现革兰阳性细菌和古细菌也有分泌 OMVs 的现象[13-16]。因此，所有原核细胞均可形成 OMVs，表明其在生物产生和进化的过程中起着关键的作用[17-19]。

2 结构和成分

OMVs 除了典型的球形结构（图 1），在古细菌和其他细菌中还发现了管形和荚状囊泡等形状结构[20-21]。OMVs 主要包括细菌周质、外膜的细胞成分，其中的物质种类包括膜脂质、分泌蛋白、膜蛋白、脂多糖、肽聚糖以及毒力因子等，也可能包含细胞内成分，如胞内蛋白、DNA、RNA 和酶等[22-23]。一些细菌产生的 OMVs 可包裹特定物质，比如，某些细菌的 OMVs 可根据电荷包裹特定蛋白质[24-25]，但这些物质是如何进入 OMVs 的确切机制尚不清楚。包含的成分被称为“货物”，OMVs 可将其在不需要接触的情况下运送到宿主的远端部位。

图 1 OMVs 的典型球形结构

3 提取与纯化

通常，OMVs 从培养至对数生长期的菌株细胞中获得，通过多次离心和过滤步骤纯化制备，并且要确保完全消除污染物，如母体细菌碎片和游离内毒素等。采用密度梯度超速离心法初步分离纯化获得粗 OMVs，收集离心后的上清液，并经 0.22 μm 滤膜过滤以除去残留的细菌，然后经内毒素清除柱去除游离内毒素。随后，将上述液体以超滤浓缩法离心，将离心后的包含 OMVs 的沉淀重新悬浮在 PBS（pH 7.6）中，采用 BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。最后，为确保 OMVs 中没有细菌，可在琼脂生长板上孵育 OMVs，37 ℃过夜。若过夜后的琼脂板上没有细菌菌落，则证明 OMVs 制剂无菌[26-27]。

4 生物产生机制

目前，OMVs 的具体生物产生机制仍不明确，根据可能的产生机制，研究者们将其分为几种假说。

第一种假说：OMVs 的产生依赖于细胞生长和环境条件[28]。例如，改变粘质沙雷菌[29]和大肠杆菌[30]生长的温度，或假单胞菌在抗生素存在的情况下[31]，都会使其产生 OMVs。鼠伤寒沙门菌 OMVs，在模拟细胞内环境的有限营养条件下富含与营养转运有关的膜蛋白，但在营养丰富条件下富含参与翻译和细胞代谢的胞浆蛋白[32]。还有研究发现，脱氮作用会使铜绿假单胞菌产生大量 OMVs，并且在一氧化氮刺激下会产生细菌素和脓菌素。因此，研究人员认为脓菌素的产生与 OMVs 产生的调控机制可能存在密切关系[33]。

第二种假说：减少外膜和其下层肽聚糖之间的交联会使 OMVs 产生增加[34]。革兰阴性细菌的细胞膜由外膜和内膜组成，细胞质周围有一薄层肽聚糖连接着这两种膜。Lpp 是一种丰富的外膜脂蛋白，共价交联外膜和肽聚糖层。当 Lpp 被分解或合成的肽聚糖所破坏时，外膜的一小部分就会从肽聚糖层解离并向细胞外凸起，形成类似球形的隔室，即为囊泡[35]。鲍曼不动杆菌[36]和大肠杆菌[35]产生 OMVs 的情况就是如此。

第三种假说：周质中错误折叠的蛋白质或异常的包膜成分累积会促进 OMVs 形成。异常累积的细胞成分在高压环境下将降低包膜完整性，从而使肽聚糖层和外膜层分离，向外突出一部分形成 OMVs[37]。此外，还有理论认为外膜生物物理特性的改变可能导致 OMVs 形成[38]。在外膜中加入特定修饰的脂多糖（LPS）、磷脂或其他诱导膜弯曲的分子，均会使膜的灵活性和流动性发生变化，导致膜曲率增加，从而产生 OMVs[39]。并且，维持细菌膜完整性所必需的 Tol-Pal 系统也可以调节 OMVs 的产生，如幽门螺杆菌[40]和波伊德志贺菌[41]就通过这种机制产生 OMVs。

虽然迄今为止所描述的大多数 OMVs 的生物产生机制是物种特异性的，但基于高度保守磷脂转运体（VacJ/YrB ABC）的革兰阴性细菌中 OMVs 生物合成的潜在普遍机制已被报道。VacJ/YrB ABC 表达减少会导致细菌外膜中诱导弯曲的磷脂聚集，从而外膜膨出、分离并产生 OMVs[42]。

5 OMVs 介导的免疫调节和发病机制

OMVs 通过多重机制调节并作用于宿主的天然免疫反应，从而使宿主发病。早期许多发病机制的研究集中在 OMVs 与黏膜表面的上皮细胞之间的相互作用以及由此导致的上皮细胞完整性的破坏。众所周知，OMVs 通过多种机制进入黏膜上皮细胞，如幽门螺杆菌、牙龈卟啉单胞菌和铜绿假单胞菌等[43-45]。OMVs 均是通过富含胆固醇的脂筏进入黏膜上皮细胞。人上皮细胞对多种病原体（如幽门螺杆菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌）的 OMVs 作出响应，产生一系列促炎分子，包括白细胞介素-8（IL-8）[46-48]等，导致产生免疫调节及不良反应[22]。最近有研究报道，OMVs与宿主细胞相互作用以介导炎症和免疫的新机制，下文将对这些机制进行讨论。

5.1 OMVs 与上皮细胞相互作用

OMVs 与上皮细胞之间的相互作用可以调节细胞增殖[49]、凋亡[50]和免疫反应[51]。阪崎肠杆菌，一种能引起新生儿严重的脑膜炎和小肠结肠炎的病原体，它所产生的 OMVs 可被肠壁细胞内吞，从而诱导细胞增殖、分泌 IL-8、使细菌持续生存[52]。而且，大肠杆菌、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉杆菌、霍乱弧菌等产生的包含细菌 RNA的 OMVs 在上皮细胞中具有免疫刺激能力[53-56]。强毒力大肠杆菌产生的 OMVs 通过细胞内吞作用进入人肠上皮细胞，释放 OMV 相关毒力因子，诱导 caspase-9 介导细胞凋亡和免疫反应，尤其是 IL-8 的分泌[50]。

5.2 OMVs 与固有免疫系统相互作用

目前已有多项研究证实，OMVs 可能在防止补体介导的杀灭细菌方面发挥重要作用，从而使病原体在宿主体内存活。如霍乱弧菌 OMVs 含有的毒力因子 OmpU 可使血清敏感性霍乱弧菌在补体介导的杀灭中存活[57]。牙龈卟啉杆菌 OMVs 含有 PPAD 酶，它使补体因子 C5a 功能丧失，使牙龈卟啉杆菌免疫逃逸[58]。脑膜炎奈瑟菌 OMVs 与一种急性炎性糖蛋白长角蛋白 3 结合，该蛋白在调节补体活化、细菌性脑膜炎和脓毒症的发病机制中起着重要作用[59]。

最初研究发现，含有大量病原相关分子模式（PAMPs 如 RNA、DNA、LPS、脂蛋白和肽聚糖）的 OMVs 可以与宿主模式识别受体（PRRs）相互作用，从而诱导固有免疫反应。例如，幽门螺杆菌、淋病奈瑟菌和铜绿假单胞菌产生的 OMVs 进入宿主上皮细胞，随后被胞质免疫受体 NOD1 检测，从而产生 NOD1 依赖的固有性和 OMV 特异性免疫应答[45]。一旦 OMVs 被上皮细胞内化，它们就会被宿主细胞内 NOD1 依赖的自噬降解方式降解，从而产生炎症反应[60]。大肠杆菌 OMVs 通过其毒力因子刺激宿主免疫系统，使宿主巨噬细胞产生 IL-6 和 TNF-α，引起脓毒症[61]。此外，OMVs 还能将 LPS 传递给宿主细胞胞浆，诱导 caspase-11 非典型炎症小体通路的激活，从而导致细胞死亡和 caspase-11 的激活，这可能是一种重要的抗细菌感染机制[62]。

5.3 OMVs 与适应性免疫系统相互作用

OMVs 可以通过多种机制调节对细菌病原体的适应性免疫反应，但 OMVs 激活或抑制免疫反应的能力可能取决于它们携带的物质及其细菌来源。例如，脑膜炎菌OMVs 既可以抑制人 CD4+T 细胞的活化和增殖以在感染部位周围产生免疫抑制，又可以诱导 CD4+T 细胞的增殖，这些结果的不同可能是由于细菌菌株的不同所致[63-64]。幽门螺杆菌 OMVs 通过刺激人单核细胞释放促炎性（IL-6）和抗炎性（IL-10）细胞因子调节宿主免疫反应，从而抑制 CD4+T 细胞增殖、诱导 T 细胞凋亡[65]。相反，卡他莫拉菌和流感嗜血杆菌 OMVs 具有激活人 B 细胞的作用[66-67]。

总之，细菌 OMVs 在启动和调控发病机制中的重要贡献日益突显。OMVs 作为致病性纳米粒子，可以从黏膜外传播到宿主体内的远端部位，最终破坏宿主细胞，使细菌存活，导致宿主发病。未来研究 OMVs 生物发生及其组成的调控将促进在调节发病机制和疾病状态方面的研究。

6 在医药与生物技术方面的应用

OMVs 的包载和脱细胞特性使它们具有将源细菌中的生物物质运送到宿主远端位置的功能，从而实现细菌间或细菌与宿主间信息交流、物质运输等。因此，可以将 OMVs 设计成纳米载体或药物递送载体用于呈递抗原、抗癌药物以及其他特定物质。

6.1 OMVs 作为信息交流工具

OMVs 如同信号分子，具有传递物种内或物种间信息的作用，如提供养分、降解竞争细菌和水平基因转移等。因此，OMVs 可作为信息交流工具。它作为共同的资源，有益于共生细菌和源细菌。例如，含有清除酶（如蛋白酶或纤维素酶）的 OMVs 被传递到营养少的环境中有助于养分的获取，从而为源细菌或共生细菌提供生存优势。携带菊粉降解酶的卵形拟杆菌 OMVs 在菊粉培养基中支持非利用菊粉的普通拟杆菌生长，证明OMVs 在拟杆菌的生态交流中发挥作用[68]。结核分枝杆菌 OMVs 携带铁质分枝菌素，这是一种铁捕获系统，有助于在敌对的宿主环境中远距离捕获铁这种必需的营养物质[69]。当然，OMVs 的信息交流是一把双刃剑。有些细菌通过 OMVs 将水解酶和蛋白水解酶传递给竞争细菌，将其杀灭并利用竞争细菌溶解后释放的营养物质供给自己[70]。

近几年，有研究发现 OMVs 在抗菌素耐药性中起作用。含有 β-内酰胺酶的 OMVs 不仅使产生菌具有抗药性，而且使其他细菌也具有抗药性，包括在感染部位与源细菌共存的致病菌[71-72]。胞质 DNA 与 OMVs 的结合使 DNA 交换成为可能[73]，而这种 DNA 交换会导致抗生素耐药性在细菌之间的转移，如鲍曼不动杆菌。OMVs 可以将双链 DNA 转移到同一物种或其他种属细菌，如大肠杆菌中[74]。从食源性病原体大肠杆菌 O157:H7 分离的 OMVs 可以将毒力因子等遗传物质转移给受体细菌，如肠内沙门菌血清肠易激菌或大肠杆菌 JM109，从而使受体细菌对宿主细胞有更大的细胞毒性[75]。OMVs 介导的 DNA 转移对从宿主细胞到混合微生物群落中的细菌进化都具有重要作用。

6.2 OMVs 作为疫苗

由于 OMVs 中的膜相关蛋白和毒力因子可诱导细胞产生免疫反应，表明 OMVs 可以作为免疫原性物质刺激细胞阻止病原体入侵[22]。因此，具有高免疫原性和非复制性的 OMVs 是疫苗的优良候选者之一。第一个被报道的是脑膜炎奈瑟菌 OMVs[76]。目前，B 型脑膜炎奈瑟菌 OMVs 已被开发成一种疫苗，商品名为 Bexsero，由诺华公司研发，于 2013 年 1 月由欧盟委员会批准在欧洲上市。

目前，将 OMVs 经基因工程改造用于疫苗的制备研究，展示了广阔的应用前景。研究发现，表达外来抗原的工程细菌 OMVs 可设计成疫苗，提供对病毒或细菌攻击的保护作用。例如，大肠杆菌基因工程 OMVs 表达外显子结构域基质蛋白 2（甲型流感病毒保守的 23 个氨基酸序列），用这种 OMVs 作为疫苗进行接种，可以保护动物免受甲型 H1N1 流感病毒的攻击[77]。此外，研究工作还集中在工程非致病菌上，使所产生的 OMVs 表达具有生物学作用的外来细菌的甘露聚糖。例如，使非致病性大肠杆菌 OMVs 表达肺炎链球菌的表面聚糖，这些 OMVs 则能够产生与市售可得的肺炎链球菌疫苗相当的免疫应答[78]。

此外，革兰阳性细菌的 OMVs 也能诱导体内产生保护性免疫反应。结核分枝杆菌OMVs 对小鼠给药，可产生保护性细胞免疫和体液免疫应答[79]。金黄色葡萄球菌 OMVs 进行疫苗接种，可以防御活跃的金黄色葡萄球菌的攻击[80]。

6.3 OMVs 作为佐剂

脂多糖（LPS）是革兰阴性细菌外膜的主要组成部分，可引起强烈的炎症反应并调节免疫应答，刺激细胞产生抗多种抗原的抗体。因此，革兰阴性细菌 OMVs 中的 LPS 是疫苗的良好佐剂[81]。LPS 由内毒素脂质 A、核心多糖和 O 抗原组成，O 抗原是一种暴露在细菌外膜表面的多糖，它是细菌菌体抗原的抗原决定簇。但是，作为佐剂的 OMVs 需要适当减弱 LPS 毒性，通过基因改造就可以达到减毒目的。

典型病原体（如大肠杆菌和沙门菌等）的脂质 A 有6 个脂肪酰基链，其中的 LpxL 基因是脂质 A 生物合成中的一种酰基转移酶。有研究表明在脑膜炎奈瑟菌突变株中具有与典型病原体 LpxL 同源的突变基因 LpxL 1，该基因同样参与脂质 A 的酰基化，使突变株脂质 A 产生 5 个脂肪酰基链而不是 6 个。因此，研究者通过基因工程构建了脑膜炎奈瑟菌 LpxL 1 突变体，发现缺乏脂质 A 生物合成基因 LpxL 的脑膜炎奈瑟菌突变株在保持良好佐剂活性的同时毒性比野生型菌株低[82]。引入外源 LPS 修饰酶也可以改变 LPS 结构。如在大肠杆菌中表达的幽门螺杆菌 Hp 0021（脂质 A-1-磷酸酶的结构基因）可在其中合成单磷酸脂质 A，而不是天然二磷酸化形式，这很可能减少宿主固有免疫反应的刺激[83]。

总之，基因工程改造后的 OMVs 有两个优点：既可以发挥脂多糖在免疫过程中的佐剂作用，又可以通过基因操作使其融合靶蛋白，两者均有助于增强免疫应答。

6.4 OMVs 作为药物递送系统

虽然人工合成的纳米材料载体（如脂质体、聚合物胶束、金属纳米粒子等）被认为是高效的药物转运体，但是这些载体并不能进行有效的细胞间相互作用[84]。OMVs 比这些药物载体更有优势，由于其独特的生理特性而成为高靶向的药物递送系统[85]。

有研究报道称包含外源基因 siRNAs 的 OMVs 可以影响或控制靶细胞翻译后水平的基因表达。从治疗的角度看，OMVs 具有介导遗传物质向癌细胞转移的能力，从而利用抗肿瘤 siRNAs 沉默靶基因的表达实现治疗癌症的目的。而且，miRNAs 也可用作 RNA 传递系统和 RNA 干扰机制的潜在治疗工具。

研究者们将 OMVs 进行基因和表面修饰使其以细胞特异性的方式靶向和杀伤癌细胞[86]。比如，将抗 HER2 亲和体融合到生物工程细菌（大肠杆菌）OMVs 的 ClyA 上，从而把显示抗 HER2 亲和体的 OMVs 作为一种靶向配体[26]。然后将 OMVs 通过电穿孔负载小干扰 RNA（siRNA）靶向于运动素纺锤体蛋白。结果表明，给小鼠注射包载 siRNA 的 OMVs 可导致靶基因沉默并抑制 HER2 阳性肿瘤细胞生长，而且经修饰的 OMVs 具有良好的耐受性且无明显的毒副作用。

将 OMVs 和 miRNA 结合也可以治疗癌症（如肠癌），从自身肠道细菌中提取 OMVs，将其包裹抗肿瘤 miRNA 后，可以通过口服输送到胃肠道的癌组织，OMVs 和 miRNA 的结合可有效抑制转移性肿瘤细胞[83]。总之，作为一种天然载体系统，OMVs 用于药物递送具有广阔前景。

7 小结与展望

综上所述，OMVs 的纳米尺寸和双层脂质膜结构使其成为一种新型的纳米药物递送系统。本文讨论了 OMVs 的三种可能形成机制，在形成过程中 OMVs 捕获源细菌内的“货物”，并且不同“货物”对其生物医学应用至关重要。此外，OMVs 可被抗原提呈细胞识别，从而激活宿主固有免疫和适应性免疫应答，并且可通过基因工程改造促进其与肿瘤细胞表达的目标受体结合，递送抗肿瘤性“货物”（如 siRNA、miRNA 和蛋白质等）到靶细胞中，从而导致肿瘤细胞死亡。而且，OMVs 还具有促进细胞间信息交流，具有获取养分、降解竞争细菌和基因转移等作用，使其可被应用于疫苗、佐剂、药物递送系统等领域。

尽管 OMVs 的发展还存在一些障碍，如关于 OMVs 的生物发生和分泌的详细机制以及“货物”选择性、被宿主细胞内化的机制等很多问题尚不清楚，但它仍有许多值得深入研究的优势。今后，若能累积更多与 OMVs 相关的研究信息，充分发挥其潜力，OMVs 将成为一种高创新技术，其应用将发展得更广泛、更新颖，这些在疾病治疗和预防方面的应用也将对人类的健康做出重要贡献。

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中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2017-I2M-1-012）

李桂玲，Email：liguiling1999@163.com

2018-06-13

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.012