赵巍，吴兆伟，张喆，胡琴，王琳



注射用盐酸甲氯芬酯及有关物质的毒性研究

赵巍，吴兆伟，张喆，胡琴，王琳

102206 北京市药品检验所中药成分分析与生物评价北京市重点实验室

研究注射用盐酸甲氯芬酯及有关物质的小鼠异常毒性及细胞毒性。

预实验确定给药剂量，正式实验 120 只小鼠随机分组（雌雄各半，每组 12 只），给药后连续观察 30 min，记录小鼠异常反应情况。应用小鼠肝脏细胞AML-12观察药物的细胞毒性。

盐酸甲氯芬酯的杂质根据结构可分为对氯苯氧乙酸类似物和胆碱类。对氯苯氧乙酸类似物具有镇静作用，且安全范围高于盐酸甲氯芬酯，胆碱类杂质具有明显的外周胆碱类反应，具有刺激性毒性。各杂质对注射用盐酸甲氯芬酯的体外细胞毒性基本无影响。

盐酸甲氯芬酯胆碱类杂质毒性较高，需重点关注。该研究为制定注射用盐酸甲氯芬酯质量标准提供科学依据，提高临床用药的安全性及有效性。

甲氯芬酯； 异常毒性； 细胞毒性

注射用盐酸甲氯芬酯为苯氧乙酸酯类中枢兴奋药，主要作用于大脑皮质[1-3]，临床上用于治疗外伤性昏迷、酒精中毒、新生儿缺氧症、儿童遗尿症、意识障碍等[4-6]。不良反应主要有睡眠差、恶心、纳呆等，注射后偶见皮疹、头痛现象[7-9]。由于盐酸甲氯芬酯结构中含有酯键，在水和醇溶液中极易降解，产生大量杂质，严重影响产品质量及临床用药的安全有效[10-12]。因此，对注射用盐酸甲氯芬酯及其有关物质的毒性研究尤为重要。

研究表明，注射用盐酸甲氯芬酯的有关物质主要为对氯苯氧乙酸（杂质 A）、对氯苯氧乙酸乙酯（杂质 C）和 N,N-二甲氨基乙醇（杂质 D），结构如图 1 所示。其中，杂质 A 既是盐酸甲氯芬酯的合成起始物料，又是其水解产物，在制剂中含量高达 1%；杂质 C 是原料药合成中产生的酯交换产物；杂质 D 无紫外吸收，且在质谱检测器中检出浓度较高[13]。为进一步确定有关物质的杂质限度，对该品种质量风险进行合理监控，本研究分别采用小鼠模型和细胞模型对注射用盐酸甲氯芬酯及含量大于 0.1% 的有关物质进行毒性研究，发现杂质 D 的毒性较高，需重点关注。本研究结果为科学监管提供了有力的支撑，对注射剂仿制药质量一致性评价起到积极引导和示范作用。目前国内尚未见有关研究报道。

图 1 盐酸甲氯芬酯及有关物质结构

Figure 1 Structure of meclofenac hydrochloride and related substances

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试药与仪器 盐酸甲氯芬酯对照品（批号 100840-201402，含量 99.7%）购自中国食品药品检定研究院；杂质对照品对氯苯氧乙酸（批号 05621LT-1）购自北京百灵威科技有限公司；其余杂质对照品均由中国医学科学院药物研究所协助合成。辅料甘露醇（批号 361504002）由青岛明月海藻集团有限公司提供；胰酶（批号 R001100）由 ThermoFisher 公司生产；双抗（批号 SV30010）由美国 Hyclone 公司生产；标准胎牛血清（批号 12484-010）由美国 Gibco 公司生产。实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。主要仪器为美国 BioTek 公司 mQunt 酶标仪。

1.1.2 实验动物 昆明种小鼠，SPF 级，雌雄各半，体重 18 ~ 22 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号 SCXK-(军)2012-0004。饲养温度为 22 ~ 26 ℃，自然采光照明，自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 小鼠异常毒性实验 异常毒性有别于药物本身所具有的毒性特征，是指由生产过程中引入或其他原因所致的毒性[14]。本研究中设计的异常毒性实验，即给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察实验动物出现的异常反应情况，进而对供试品中是否存在不安全因素进行评价。

盐酸甲氯芬酯经小鼠静脉注射的 LD50为 330 mg/kg，依据美国科学院毒性物质划分等级，50 mg/kg < LD50< 500 mg/kg 属于中等毒性，且具有急性毒性，小鼠口服的 LD50为 1750 mg/kg。盐酸甲氯芬酯的临床注射剂量为静脉滴注成人一次 0.1 ~ 0.25 g，一日 3 次，即成人单次剂量为 1.7 ~ 4.2 mg/kg（按成人 60 kg 体重计）。依据人体给药剂量及《中国药典》2015 版四部异常毒性检查法要求，设计盐酸甲氯芬酯的小鼠基准剂量为5 mg/kg，即大于人体单次最高给药剂量。经预试，在此基准剂量下，出现明显不同于空白对照动物的行为表现。因此，确定注射用盐酸甲氯芬酯的小鼠给药剂量为 5 mg/kg。盐酸甲氯芬酯有关物质给药量的计算，依据杂质的分子量与盐酸甲氯芬酯的分子量进行折算后，分别为：杂质 A 3.2 mg/kg，杂质 C 3.6 mg/kg，杂质 D 1.5 mg/kg，所有样品及空白对照均用 0.5% 的吐温 80 溶液溶解后静脉注射。小鼠随机分组，每组 12 只，给药后观察小鼠的异常反应，并对毒性进行评价。

1.2.2 细胞毒实验 将处于指数生长期的小鼠正常肝脏 AML-12 细胞用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，计数后稀释至 1 × 105个/ml，接种于 96 孔板中，每孔加入 100 μl 细胞混悬液，置 37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养 24 h。

将盐酸甲氯芬酯及其杂质受试物用 DMSO 溶解、然后依次稀释成多个梯度浓度，同时设阴性对照。取小鼠正常肝脏细胞株 AML-12 与用 DMSO 稀释的样品置 96 孔板中，在 37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。样品浓度分别为 0.01、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100 和 200 mmol/L。孵育 48 h 后，取出 96 孔板，每孔中加入 5 mg/ml 的 MTT 溶液 10 μl，置 37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中继续培养 4 h 时。取出，倒掉上清液，每孔加入 150 μl DMSO，置振荡器上在常温下轻度振荡 10 min，酶标仪 570 nm 和 630 nm 波长下测定吸光度（）差值（570nm–630nm）。

细胞生长抑制率%（IR）= 100% –[（受试物/溶媒对照）× 100%]

统计得回归方程，求半数抑制率（IC50），即 IR 为 50% 的药物浓度。

2 结果

2.1 小鼠异常反应及毒性评价

盐酸甲氯芬酯虽然为中枢兴奋药，但是通过减少外周消耗，来促进脑内代谢，因此在引起中枢兴奋作用的同时，外在表现为镇静。图 2A为甲氯芬酯特征反应，小鼠注射盐酸甲氯芬酯后俯卧不动，时间持续约 30 min。

盐酸甲氯芬酯的杂质根据结构可分为两类，一类是对氯苯氧乙酸类似物，包括杂质 A 和杂质 C，一类是胆碱类，包括杂质 D。小鼠注射杂质 A 和杂质 C 后，活动均稍有减弱，且反应恢复较快（图 2B）。由实验结果可知，对氯苯氧乙酸类似物具有镇静作用，且安全范围高于盐酸甲氯芬酯，因此可根据产品能达到的水平确定杂质限度。图 2C为外周胆碱特征反应，小鼠注射杂质 D 后具有明显的外周胆碱类反应。胆碱类成分刺激眼睛、呼吸系统和皮肤，注射时可能导致明显的血管刺激反应。实验结果表明，胆碱类杂质毒性强于对氯苯氧乙酸类似物，建议建立稍微严格的有关物质限度标准。

图 2 甲氯芬酯及外周胆碱特征反应（A：甲氯芬酯特征反应；B：对氯苯氧乙酸类似物反应；C：外周胆碱特征反应）

Figure 2 Meclofenate and peripheral choline characteristics (A: Meclofenate; B: p-chlorophenoxyacetic acid analog; C: Peripheral choline)

表 1 盐酸甲氯芬酯及有关物质异常反应及毒性评价

通过比较有无辅料情况下，注射盐酸甲氯芬酯后小鼠的异常反应结果（表1）可知，含辅料样品出现反应的时间略有延迟，且持续时间较短。说明辅料甘露醇会影响主成分作用发挥的速度和持续时间。因此，在使用过程中，建议选择不含辅料的制剂类型，以保障临床用药的疗效。

2.2 细胞毒性评价

实验结果表明（表2），孵育 48 h 后盐酸甲氯芬酯及水解杂质的毒性基本一致，达到半数抑制率时样品浓度均大于 100 μmol/L，醇解杂质的毒性略高，达到半数抑制率时样品浓度为 83.54 μmol/L，但无显著性差异。因此，各杂质对注射用盐酸甲氯芬酯的体外细胞毒性基本无影响。

表 2 细胞毒性结果

2.3 有关物质限度研究

由小鼠异常毒性和细胞毒性结果可知，盐酸甲氯芬酯的有关物质中，杂质 D 具有明显的外周胆碱作用，其毒性强于杂质 A 和 C，还可能导致注射时出现明显的血管刺激反应，因此建议制定较为严格的有关物质限度标准。杂质 D 无紫外吸收，且在质谱检测器中检出浓度较高，在 TLC 中难以达到精准定量的要求，不适合常规检测器的测定。根据盐酸甲氯芬酯水解反应机制及文献[15]可知，杂质 D 与杂质 A 等比例生成，故在无法准确测定杂质 D 的情况下，可通过杂质 A 的含量来控制水解杂质的生成量。虽然醇解反应也产生杂质 D，但样品中水解杂质含量是醇解杂质含量的 7 ~ 70倍，因此杂质 D 主要来源于水解反应。基于上述考虑，拟对水解杂质 A 进行单独控制，并参考 ICH 的相关要求[16]，建议将其限度定为：不得超过 0.2%。

3 讨论

本研究中，分别采用小鼠模型和细胞模型对注射用盐酸甲氯芬酯及其有关物质进行毒性研究，发现胆碱类杂质毒性较高，需重点关注，以减少药物的不良反应，降低临床用药的风险。通过研究，还确认了注射用盐酸甲氯芬酯高风险杂质及质量控制关键步骤，指导企业优化相应的生产工艺，提升了产品质量，为科学监管提供技术保障和执法依据，促进了国产仿制药质量的不断提高，加强了对高风险注射剂品种的风险防控，为注射剂的仿制药质量一致性评价提供有力的技术支撑。

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Study on the toxicity of meclofenac hydrochloride for injection and related substances

ZHAO Wei, WU Zhao-wei, ZHANG Zhe, HU Qin, WANG Lin

Beijing Institute for Drug Control, Beijing Key Laboratory of Analysis and Evaluation on Chinese Medicine, Beijing 102206, China

To study the abnormal toxicity in mice and cytotoxicity of meclofenac hydrochloride for injection and related substances.

In the preliminary experiment to determine the initial dose, the mice were grouped randomly (half male and half female, 12 mice per group) in the formal experiment. The animal reactions were recorded for 30 minutes. The cytotoxicities on mouse liver cells AML-12 were measured.

The impurities of meclofenac hydrochloride can be divided into p-chlorophenoxyacetic acid analogues and choline bases according to the structure. The former has a sedative effect and the safety range is higher than that of meclofenac hydrochloride. Choline impurities have obvious peripheral choline response and high toxicity. The impurities had no effect on thecytotoxicity of meclofenac hydrochloride for injection.

The toxicity of choline impurities is high and attention must be paid to monitor of the related substances of meclofenac hydrochloride for injection, to improve the safety and effectiveness of clinical medications.

Meclofenoxate; Abnormal toxicity; Cytotoxicity

WANG Lin, Email: lindawang2225@163.com

王琳，Email：lindawang2225@163.com

2018-07-16

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.009