高海娜，蔡周权，林莺，文霞，孙慧峰



松脂醇二葡萄糖苷对光老化HDF细胞ER/TGF-β1/Smads信号通路的调控机制

高海娜，蔡周权，林莺，文霞，孙慧峰

621000 绵阳，四川省科学城医院药剂科（高海娜、蔡周权、林莺、文霞）；150040 哈尔滨，黑龙江中医药大学药学院（孙慧峰）

从分子生物学水平探讨杜仲中松脂醇二葡萄糖苷（PDG）对光老化人真皮成纤维细胞（HDF）ER/TGF-β1/Smads 信号通路的调控机制。

建立以长波紫外线模型损伤 HDF 细胞。给予不同浓度 PDG 和通路阻断剂进行干预，用MTT 检测细胞增殖率，Real time-PCR 和 Western blot 法检测各组细胞内含有的信号转化生长因子（TGF-β1）、转导分子（Smad3）、I 型胶原（COL1A1）对应 mRNA 和蛋白的表达。

与空白组比较，模型组增殖率及 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 和蛋白表达均显著降低（< 0.01）；与模型组比较，各给药组增殖率和 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 和蛋白表达均显著升高（< 0.01）；与 PDG 高浓度组比较，TGF-β1、Smad3、ER 三个阻断剂组相对应的 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 相应 mRNA 和蛋白表达均显著降低（< 0.01）。

PDG 能增加 HDF 细胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 对应 mRNA 和蛋白表达，对光老化 HDF 细胞胶原合成有促进作用；但这种作用能被 TGF-β1、Smad3 和 ER 阻断剂所抑制，PDG 促进胶原合成的作用机制可能与 ER/TGF-β1/Smads 信号通路有关。

松脂醇二葡萄糖苷； 人真皮成纤维细胞； 植物雌激素； ER/TGF-β1/Smads 信号通路

长波紫外线（UVA）可以导致表皮中的角质形成细胞以及真皮的纤维细胞构型异常的转变[1-4]。杜仲对正常成纤维细胞 I 型胶原蛋白有保护作用，但具体成分还不明确[5-6]。杜仲中松脂醇二葡萄糖苷（pinoresinol diglucoside，PDG）是一种天然弱雌激素样物质，它与皮肤光老化有密切关系。有研究揭示光老化患者皮肤中雌激素受体β（ERβ）的表达强度和老化的严重程度有着密切的关系，雌激素受体在光老化患者皮肤中发挥了重要作用[7-8]。Smads 蛋白家族是一种转录因子，它是 TGF-β 受体作用的中介物质[9-10]。Son 等[11]报道 17β 雌二醇（E2），可促进TGF-β1 和 Smad3 表达增加，使胶原合成增加，表明在 TGF-β/Smad 信号通路调控机制中 17β 雌二醇促进了胶原的合成，可用于治疗人的皮肤病。胶原合成主要通过 ER/TGF-β/Smads 信号通路实现，植物雌激素成分干预胶原蛋白合成的作用机制为合理利用中药植物促激素预防皮肤光老化等疾病提供理论依据[12]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人真皮成纤维细胞（HDF）购自美国 Sciencell 公司。

1.1.2 试剂 17β 雌二醇纯度为 98%，购买于北京百灵威科技有限公司，生产批号为 L750N46；PDG 纯度为 98%，购买于宝鸡市辰光生物科技有限公司，生产批号为 MUST-13021001；COL1A1 阻断剂 SB431542（生产批号301836-41-9）和Smad3 阻断剂 SIS3（生产批号 1009104-85-1）以及TGF-β1、COL1A1、Smad3、HRP 标记羊抗兔 IgG 均购自Santa Cruz Biotechnogy；TGF-β1 阻断剂 ICI182780（生产批号 20A/129473）购自 Tocris 公司；HRP 标记羊抗小鼠 IgG 购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要仪器 UVA 紫外照射仪购自北京师范光电仪器厂；MK3 型酶标仪购自上海热电仪器有限公司；WD9405B 型水平摇床购自北京市六一仪器厂；TCL6G-C 型高速台式冷冻离心机购自上海安亭科学仪器厂；Mini-Protean Tetra Cell 型电泳仪购自Bio-Rad 公司；PCR 自动扩增仪购自德国Biometra 公司；Smart ChemiTM500 型一体式微型化学发光成像仪和ChamlGelTM5000 透射紫外观察仪及凝胶成像系统购自北京赛智创业科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 将对数期生长的 HDF 细胞，以 105每孔接种到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2条件下，用 FM 培养液培养。实验分组为空白组（2 ml FM + 培养 24 h）、模型组（2 ml FM + 培养 23 h + 20 J/cm2UVA 照射 + 培养 1 h）、阳性对照组（10-3μmol/L 雌二醇 + 2 ml FM + 培养23 h + 20 J/cm2UVA 照射 + 培养 1 h）、药物低剂量组/ 药物中剂量组/ 药物高剂量组（10-1μmol/L /1 μmol/L / 10 μmol/L PDG + 2 ml FM + 培养 23 h+ 20 J/cm2UVA 照射 + 培养 1 h）、阻断剂组（1 μmol/L ICI182780 / 10 μmol/L SIS3 / 10 μmol /L SB431542 培养 1 h + 10 μmol/L PDG + 2 ml FM + 培养 22 h + 20 J/cm2UVA 照射 + 培养 1 h），每组均设 4 个复孔。

1.2.2 MTT 检测 细胞培养 20 h 后，每孔加入 20 μl 浓度为 5 g/L 的 MTT，再继续培养 4 h 后，除去上清液，每孔加 150 μl DMSO，将 96 孔板置于 37 ℃恒温振荡培养器内振荡 10 min，使紫色结晶完全溶解。酶标仪 490 nm 波长处测定吸光度。

1.2.3 Real time-PCR 反应 取对数增长 HDF 细胞，使用裂解液提取总的 RNA，用 Nano-100 测定总 RNA 的浓度及纯度，将 RNA 反转录为 cDNA 置于–20 ℃冰箱储存待用，选 GAPDH 为内参，引物序列见表 1，反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性 30 s；58 ℃退火/延伸60 s，2 ℃延伸 60 s，31 个循环；2 ℃延伸 60 s。然后每孔 10 μl 将扩增产物加入到琼脂糖凝胶进行 120 V 30 min 电泳，最后在凝胶成像系统进行检测，循环阈值即 Ct 值，每组设三个平行实验。按照 2-△△Ct法分析细胞内目的基因相对于内参基因的 mRNA 的相对表达量。△△Ct =（Ct目的基因– Ct内参基因）给药组–（Ct目的基因– Ct内参基因）对照组。

1.2.4 Western blot 取对数增长 HDF 蛋白浓度，计算出样品蛋白浓度，将 10 μl 蛋白样品加入对应的胶孔中，电泳仪电压为 100 V，电泳 60 min。半干转膜仪电压为 10 V，转染 0.5 h。脱脂奶粉封闭 2 h，一抗（1:330）孵育 4 ℃过夜，TBST 洗3 遍，二抗（1:10000）孵育 1 h，TBST 再洗 3 遍，将 PVDF 膜稍微淋一下，加 ECL 显色，暗室显影，摄影并进行分析。采用 LaneID 凝胶分析系统，分析各条带的灰度值，以靶条带的灰度值和内参的灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 采用 MTT 法检测 PDG 对 UVA 照射 HDF 细胞增殖作用的影响

实验结果如表 2，与空白组相比，模型组的 HDF 细胞增殖率显著减少（< 0.01）；与模型组相比，PDG 低中高（10-1μmol/L、1 μmol/L 和10 μmol/L）三种剂量对 HDF 细胞的增殖率均具有促进作用（< 0.05）。

2.2 PDG 对光老化 HDF 细胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表达的影响

实验结果如表 3，与空白组相比，模型组中 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 mRNA 表达均显著减少（< 0.01）；与模型组相比，阳性对照组和 PDG 高剂量组 TGF-β1、Smad3 和COL1A1 mRNA 表达均显著增加（< 0.01）。

2.3 PDG 对光老化 HDF 细胞 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 蛋白表达的影响

实验结果如表 4 和图 1，与空白组相比，模型组 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表达均显著减少（< 0.01）；与模型组相比，阳性对照组和PDG 低剂量组、中剂量组、高剂量组中 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表达均显著增加（< 0.01）。

表 1 引物

表 2 PDG 对 UVA 照射 HDF 细胞增殖率的影响（，n = 6）

注：与空白组比较##< 0.01；与模型组比较*< 0.05。

Note: Compared with the blank group,##< 0.01; compared with the model group,*< 0.05.

表 3 PDG 对光老化 HDF 细胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表达的影响（，n = 3）

注：与空白组比较##< 0.01；与模型组比较**< 0.01。

Note: Compared with the blank group,##< 0.01; compared with the model group,**< 0.01.

表 4 PDG 对光老化 HDF 细胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白表达的影响（，n = 3）

注：与空白组比较##< 0.01；与模型组比较**< 0.01。

Note: Compared with the blank group,##< 0.01; compared with the model group,**< 0.01.

A: Control; B: UVA + E2 (10-3μmol/L); C: 20 J/cm2UVA; D: UVA + PDG (10-1μmol/L); E: UVA + PDG (1 μmol/L); F: UVA + PDG (10 μmol/L)

Figure 2 Effect of PDG on expression of TGF-β1, Smad3 and COL1A1 protein in photo-aging HDF cells

2.4 阻断 ER/TGF-β1/Smads 后 PDG 对光老化HDF 细胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表达的影响

实验结果如表 5，与空白组相比，模型组中TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表达均显著减少（< 0.01）；与模型组相比，PDG 高剂量组 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表达均显著增加（< 0.01）；与 PDG 高剂量组相比，TGF-β1 阻断剂 SB431542、Smad3 阻断剂 SIS3、雌激素受体阻断剂 ICI182780相对应的 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 mRNA 表达均显著减少（< 0.01）。

表 5 阻断 ER/TGF-β1/Smads 后 PDG 对光老化 HDF 细胞 TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA 表达的影响（，n =3）

注：与空白组比较##< 0.01；与模型组比较**< 0.01；与药物高剂量组比较#< 0.01。

Note: Compared with the blank group##< 0.01; compared with the model group**< 0.01; compared with the high dose group#< 0.01.

组别 GroupsTGF-β1/β-actinSmad3/β-actinCOL1A1/β-actin 空白组 Control0.636 ± 0.0140.889 ± 0.0120.982 ± 0.042 UVA0.234 ± 0.019##0.262 ± 0.018##0.331 ± 0.023## UVA + PDG0.462 ± 0.013**0.501 ± 0.016**0.564 ± 0.018** UVA + PDG + SB4315420.275 ± 0.018#0.392 ± 0.017#0.438 ± 0.015# UVA + PDG + SIS30.282 ± 0.023#0.301 ± 0.011#0.430 ± 0.068# UVA + PDG + ICI1827800.322 ± 0.016#0.332 ± 0.021#0.392 ± 0.026#

注：与空白组比较##< 0.01；与模型组比较**< 0.01；与药物高剂量组比较#< 0.01。

Note: Compared with the blank group##< 0.01; compared with the model group**< 0.01; compared with the high dose group#< 0.01.

A: Control; B: UVA; C: UVA + PDG; D: UVA + PDG + SB431542; E: UVA + PDG + SIS3; F: UVA + PDG + ICI182780

Figure 2 Influence of PDG on expression of TGF-β1, Smad3 and COL1A1 proteins in photoaging HDF cells after blocking ER/TGF-β1/Smads

2.5 阻断ER/TGF-β1/Smads后PDG对光老化HDF细胞TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白表达的影响

实验结果如表 6 和图 2，与空白组相比，模型组中 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表达均显著减少（< 0.01）；与模型组相比，PDG 高剂量组 TGF-β1、Smad3、COL1A1 蛋白的表达均显著增加（< 0.01）；与 PDG 高剂量组相比，TGF-β1 阻断剂 SB431542、Smad3阻断剂 SIS3、雌激素受体阻断剂 ICI182780相对应的 TGF-β1、Smad3 和 COL1A1 蛋白的表达均显著减少（< 0.01）。

3 讨论

皮肤的光老化严重影响人们的容颜，给人身体造成严重心理负担。皮肤光老化主要发病的原因是胶原合成减少，而胶原合成主要通过 ER/TGF-β/Smads 信号通路实现，其中 TGF-β1、Smad3、I 型胶原在 HDF 细胞中的表达可以作为评估光老化模型的特异性指标[13-15]。选择植物雌激素来研究其对胶原合成的影响及其调控机制，对于寻找安全有效的治疗皮肤光老化的天然植物类药物具有重大意义。

综上所述，PDG 能通过影响 ER/TGF-β1/Smads 信号通路显著上调 UVA 诱导的光老化 HDF 细胞 TGF-β1、Samd3、COL1A1 蛋白及 mRNA 的表达，增加光老化 HDF 细胞的增殖能力，为中药治疗光老化等皮肤疾病提供了理论基础和实验依据。

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Regulatory role of pinoresinol diglucoside in the ER/TGF-β1/Smads signaling pathways in photo-aged HDF cells

GAO Hai-na, CAI Zhou-quan, LIN Ying, WEN Xia, SUN Hui-feng

Sichuan Science City Hospital, Mianyang 621000, China (GAO Hai-na, CAI Zhou-quan, LIN Ying, WEN Xia); Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China (SUN Hui-feng)

To study the effect of pinoresinol diglucoside (PDG) on the ER/TGF-β1/Smads signaling pathways in photo-aged human dermal fibroblasts (HDF) cells.

A long wave ultraviolet (UVA) model was established to damage the HDF cells, and different concentrations of PDG and ER/TGF-β1/Smads signaling pathway inhibitors were added. The cell proliferation rate was detected by MTT, and the expression of signal transforming growth factor (TGF- β1), transduced molecule (Smad3) and type I collagen (COL1A1) expression were detected by RT-PCR and Western blot method.

Compared with the control group, the proliferation rate and the expression of TGF-β1, Smad3, COL1A1 mRNA and protein in the UVA irradiated model group were significantly decreased (< 0.01). Compared with the model group, the proliferation rate and TGF-β1, Smad3, and COL1A1 expression were significantly increased after PDG treatment (< 0.01). Compared with the high concentration of PDG group, the expression of TGF-β1, Smad3, and COL1A1 expression were significantly decreased, respectively, upon the treatment with respective inhibitor (< 0.01).

PDG increased the expression of TGF- β1, Smad3 and COL1A1 in HDF cells after UVA irradiation, and this effect can be inhibited by TGF-β1, Smad3 and ER inhibitor.

Pinoresinol diglucoside; Human dermal fibroblasts cells; Phyto-oestrogens; ER/TGF-β1/Smad3 signaling pathway

SUN Hui-feng, Email: huifengsun@hotmail.com

孙慧峰，Email：huifengsun@hotmail.com

2018-07-23

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.007