赵巍，胡秦，路通，程渊，李劲涛



肺癌与多瘤病毒和疱疹病毒感染关系的初步研究

赵巍，胡秦，路通，程渊，李劲涛

100035 北京市药品检验所/北京市保健食品化妆品检验中心（赵巍）；100124 北京工业大学生命科学与生物工程学院（胡秦、路通、李劲涛）；100034 北京大学第一医院呼吸和危重症医学科（程渊）

探讨常见多瘤病毒和疱疹病毒感染与肺癌的关系。

巢式 PCR 检测 26 例肺癌样本和 10 例非瘤肺部样本中的 BK 多瘤病毒、JC 多瘤病毒、疱疹病毒HHV-6、HHV-7、HHV-8 和 EB 病毒的存在情况。

肺癌组织中 HHV-6、HHV-7 和 EB 病毒 DNA 阳性率分别为 17.4%、13.0% 和 60.9%，非瘤肺部样本中 HHV-6、HHV-7 和 EB 病毒 DNA 阳性率分别为 0、12.5% 和 12.5%。在肺癌组织的 EB 病毒感染与非瘤组织 EB 病毒感染存在显著性差异（< 0.05）。所有样本中均未检出 BK 多瘤病毒、JC 多瘤病毒和 HHV-8 DNA。

EB 病毒在肺癌和非瘤肺组织的表达存在显著性差异，肺癌组织的 EB 病毒的感染在肺癌患者中普遍存在，可能对肺癌患者的治疗和预后有一定影响。

肺肿瘤； 多瘤病毒感染； 疱疹病毒科感染

肿瘤与慢性病毒感染的关系长期以来一直是肿瘤病因学的研究热点，多种病毒被发现与肿瘤发生具有相关性，如世界卫生组织（WHO）已将人乳头瘤病毒（HPV）确定为宫颈癌的主要病因[1]，此外，大量研究还发现 EB 病毒（EBV）感染与鼻咽癌和儿童淋巴瘤的发生密切相关[2]，人乙型肝炎病毒（HBV）在肝细胞癌变中发挥重要作用等[3]。病毒的反复持续感染、病毒基因整合、机体免疫力低下、遗传易感等均是促进正常细胞恶性转化的重要因素。

肺癌是我国乃至全球范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，且发病率呈现逐年上升趋势[4]。肺癌的发病机制尚不完全明确，多数研究认为肺癌的发生是多种刺激因素与机体潜在因素（如吸烟、遗传因素、电离辐射、空气污染等）综合作用的结果，其中病毒感染与肺癌发生和发展的关系仍不完全清楚。本文应用巢式 PCR 技术检测肺癌组织中常见多瘤病毒和疱疹病毒的存在情况，探讨病毒感染与肺癌发生和发展的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

从北京大学第一医院收集，因临床病情需要手术切除肺组织及支气管镜活检取样肺组织共36 例，其中肺癌组织 26 例和非肿瘤组织 10 例，标本经病理学诊断确认。其中肺癌组织中男 20 例，女 6 例，平均年龄为 64.15 岁（52 ~ 83 岁），包括肺大细胞癌 1 例，肺小细胞癌 4 例，肺鳞癌10 例，肺腺癌 6 例，其他肿瘤 5 例。对照组为非肿瘤组织，为肺部急慢性炎症患者，其中男 7 例，女 3 例，平均年龄为 58.75 岁（45 ~ 69岁），所有标本均经患者及家属的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 组织 DNA 提取和质量鉴定 组织样品取样后，于–80 ℃保存。冻存样本经 PBS 缓冲液清洗后研磨，加入 DNA 提取液和蛋白酶 K 消化组织，提取 DNA，DNA 保存于–20 ℃。为鉴定 DNA 提取质量，采用 PCR 扩增内参基因 β-globin，扩增引物为 β-globin-F：5' CAACTT CATCCACGTTCACC 3'，β-globin-R：5' GAAGAG CCAAGGACAGGTAC 3'。引物由北京天一辉远公司合成。

1.2.2 病毒核酸检测 设计 BK 多瘤病毒（BKV）、JC 多瘤病毒（JCV）、疱疹病毒 HHV-6、HHV-7、HHV-8 和 EBV 的扩增引物（表 1），由北京天一辉远公司合成。组织 DNA 样本采用巢式PCR 扩增，扩增产物采用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样本经回收后送测序，经序列比对后判断是否为阳性。

表 1 扩增引物序列

2 结果

2.1 组织 DNA 提取质量分析

提取肺部组织的总 DNA，利用 PCR 扩增内参 β-globin 基因后检测 DNA 质量，其 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图 1 所示，在 36 份组织样本中，有 31 份样本经内参扩增检测为阳性（包括 23 份癌组织样本和 8 份对照样本），表明提取的组织 DNA 质量较完整，可以进行下一步检测，5 份阴性样本不计入后续实验检测。

2.2 肺癌组织病毒核酸检出结果

肺部组织样本经巢式 PCR 扩增及测序片段比对分析后，对 31 份样本分别进行 BKV、JCV、HHV-6、HHV-7、HHV-8 和 EBV 的 PCR 核酸检测，结果如表 2 所示。肺癌及对照患者的组织中 BKV、JCV 和HHV-8 均未检出。肺癌组织（n = 23）中共检出 4 份 HHV-6，3 份 HHV-7 阳性样本和 14 份 EBV 阳性样本，阳性率分别为 17.4%、13.0% 和 60.9%。对照组织（n = 8）中共检出 1 份 HHV-7 阳性样本和 1 份 EBV 阳性样本，阳性率均为 12.5%，未检出 HHV-6 阳性样本。肺癌组与对照组的 HHV-6 和 HHV-7表达无显著性差异。肺癌组与对照组的 EBV 表达具有显著性差异（< 0.05）。

M：分子量标准；1 ~ 36：组织 DNA 样本

Figure 1 Agarose gel electrophoresis of β-globin PCR products

表 2 肺部组织的病毒核酸检出结果

3 讨论

本文检测了多种常见多瘤和疱疹病毒感染与肺癌的关系。多瘤病毒和疱疹病毒均是具有潜在致瘤性的病毒。其中 BKV 和 JCV 是两种常见的多瘤病毒，初次感染发生在婴幼儿时期，在普通人群中的感染可达 80% 或以上，可潜伏于多个器官组织，并可经呼吸道、消化道、器官移植等传播。BKV 首次发现于肾移植后出现肾衰竭患者的尿液中，JCV 首次发现于进行性多灶性白质脑病脑组织中。BKV 和 JCV 对健康人群不致病，多无临床症状，但在免疫低下人群中潜伏激活，表现出多种临床症状，如移植性肾损害、膀胱炎等。多项研究表明 BKV 和 JCV 感染与结肠癌和前列腺癌等具有相关性[5-7]，尚无研究证实 BKV 病毒感染与肺癌相关性，在我们的肺癌检测样本和对照样本中，也尚未发现 BKV 和 JCV 核酸检出。

人疱疹病毒为双链 DNA 病毒，可分为 α、β 和 γ 亚型，其中 HHV-6 和 HHV-7 属于 β 亚型，具有 75% 的同源性，对 T 淋巴细胞具有高度亲嗜性，在普通人群中感染率高，原发感染多发生在婴幼儿时期，是幼儿急疹和玫瑰疹的主要病因之一。HHV-6 潜伏感染与多发性硬化和移植后疾患有关，在口腔鳞癌等肿瘤中有 HHV-6 检出，在胃肠道肿瘤患者血液中也有检出 HHV-6 和 HHV-7 激活。HHV-6 和 HHV-7 与肺部疾病的关系尚不明确，有个案报道小细胞肺癌患者出现 HHV-6 激活诱发脑炎[8]，在移植病后肺炎（IPS）中也发现了 HHV-6 检出[9]。本文检测肺部良性疾病（肺炎等）和癌组织样本均有发现 HHV-6 和HHV-7 检出，没有显著性差异。

EBV 和 HHV-8 同属于 γ 型疱疹病毒，与多种肿瘤发生有关。其中 HHV-8 又称卡波西肉瘤相关疱疹病毒，首次在 HIV-1 病毒携带并罹患卡波西肉瘤的患者体内发现，具有嗜淋巴细胞性致癌性，与卡波西肉瘤、原发性渗透性淋巴瘤等发病率具有密切相关性，与肺癌的关系尚无报道，本文也未检出 HHV-8 阳性组织样本。EBV 为 Epstein 和 Barr 首次从 Burkitt 非洲儿童淋巴瘤细胞中分离获得，是多种恶性肿瘤的病因之一，EBV 感染人咽部上皮细胞和 B 淋巴细胞，经唾液、直接接触及血液传播，全球普通人群感染超过 90%，在健康人群无明显症状或无症状。在免疫低下时诱导细胞病理改变，EBV 感染被发现与传染性单核细胞增多、淋巴瘤和鼻咽癌关系密切[2]。在肺癌研究中，以往认为 EBV 病毒感染在亚洲患者中仅与肺淋巴上皮瘤样癌有关，高水平的 EBV DNA 检出可作为肺淋巴上皮瘤样癌的不良预后标志物[10]，但近年来多项研究发现在肺腺癌和肺鳞癌组织均有 EBV 检出[11-16]，表明 EBV 的潜伏激活与多种肺癌具有关系。本文在 23 份肺癌组织中检出 14 份 EBV 阳性样本，阳性率高达 60.9%，其中，肺癌组织样本包括 B 细胞淋巴瘤等，与 EBV 感染关系密切，检出率较高，此外，EBV 在腺癌和小细胞肺癌中均有高表达。受样本病例数限制，不同病理亚型肺癌组织与 EBV 感染的关系还不明确，有待进一步研究证实。

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Correlation between lung cancer and polyomavirus/herpesvirus infection

ZHAO Wei, HU Qin, LU Tong, CHENG Yuan, LI Jin-tao

Beijing Institute for Drug Control/Beijing Center for Health and Cosmetics Control, Beijing 100035, China (ZHAO Wei); College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China (HU Qin, LU Tong, LI Jin-tao); Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China（CHENG Yuan）

To investigate the correlation between lung cancer and polyomavirus/herpesvirus infection.

Nested PCR were conducted to detect the expression of BKV, JCV, HHV-6, HHV-7, HHV-8 and EBV in 26 lung cancer tissues and 10 controls.

In the lung cancer tissue, the positive rate of HHV-6, HHV-7 and EBV DNA were 17.4%, 13.0% and 60.9%, respectively, whereas in the control samples, the positive rate of HHV-6, HHV-7 and EBV DNA were 0, 12.5% and 12.5%, respectively. The expression of BKV, JCV and HHV-8 were not detected in all the samples.

Significant difference of EBV infection between lung cancer and control tissues is observed, indicating that EBV might be involved in the pathogenesis and prognosis of lung cancer.

Lung neoplasms; Polyomavirus infections; Herpesviridea infections

CHENG Yuan, Email: softsnake@bjmu.edu.cn; LI Jin-tao, Email: ljt2008@bjut.edu.cn

北京市自然科学基金（7182012）

程渊，Email：softsnake@bjmu.edu.cn；李劲涛，Email：ljt2008@bjut.edu.cn

2018-07-16

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.006