丁晓蕊 贾兴芳 刘成霞

[摘要] 伴随幽门螺旋杆菌（Hp）根除治疗法的逐步推广与使用，医学界开始关注抗生素耐药性越发严重的情况，该耐药性已被发现对一些Hp治疗方法的根治率有不利影响。因此，对幽门螺旋菌耐药分子机制的钻研正成为国内外研究的热点话题。例如，硝基咪唑类（甲硝唑）的耐药机制和rdxA、FrxA基因突变有重要关系。大环内酯类（克拉霉素）的耐药机制和Hp中23SrRNA里V区域的点突变存在密切关系。阿莫西林一类药物的耐药机制和青霉素结合蛋白存在关联。作为快速抑菌剂的四环素类的耐药机制和Hp16SrRNA序列的突变有关联。对耐药机制的分类研究为Hp的进一步诊断及医治奠定了重要基础。

[关键词] 幽门螺旋菌；抗生素；耐药机制；硝基咪唑类；大环内酯类

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）07（b）-0193-04

Research Progress of Antibiotic Resistance Mechanism of Helicobacter Pylori

DING Xiao-rui， JIA Xing-fang， LIU Cheng-xia

Gastroenterology Department， Affiliated Hospital of Binzhou Medical College， Binzhou， Shandong Province， 256600 China

[Abstract] With the gradual promotion and use of Helicobacter pylori （Hp） eradication therapy， the medical community has begun to pay attention to the increasingly serious situation of antibiotic resistance， which has been found to have an adverse effect on the cure rate of some Hp treatment methods. Therefore， the study of the molecular mechanism of Helicobacter pylori resistance has become a hot topic at home and abroad. For example， the resistance mechanism of nitroimidazoles （metronidazole） has an important relationship with mutations in rdxA and FrxA genes. The resistance mechanism of macrolides （clarithromycin） is closely related to point mutations in the V region of 23S rRNA in Hp. The drug resistance mechanism of amoxicillin and penicillin-binding proteins is related. The resistance mechanism of tetracyclines as a rapid bacteriostatic agent is related to the mutation of the Hp16SrRNA sequence. The classification of drug resistance mechanisms has laid an important foundation for the further diagnosis and treatment of Hp.

[Key words] Helicobacter pylori； Antibiotics； Drug resistance mechanism； Nitroimidazole； Macrolides

作為一种微需氧菌，幽门螺旋菌在显微镜下呈现为一端有鞭毛的螺旋形结构，它是格兰阴性菌的一种。检验医学已明确该种菌和胃肠消化道的常见4种疾病有密切的联系，即消化性溃疡、慢性胃炎、胃粘膜淋巴瘤和胃癌。上世纪90年代中期，世界卫生组织已将Hp定为首类致癌因子。因此，对Hp的根治疗法是临床上医治慢性胃病的关键手段，从根本上上去除Hp不但可提升消化性溃疡恢复的速度，还能有效抑制胃肠道溃疡，并且能降低初期胃癌术后的复发率。现阶段，根除Hp的常用抗生素较多，主要为大环内酯类（如克拉霉素）、硝基咪唑类（如甲硝唑）、β—内酰胺类（如阿莫西林）、喹诺酮类（左氧氟沙星）、四环素类等[1]。不过由于抗生素的普遍使用，Hp的耐药性逐渐提升。因而对Hp耐药机制方向的探究对临床后续的诊断及医治有突出的作用，该文对国内外有关治疗药物和相应的耐药机制展开综述。

细菌的耐药性大致可分为以下几点：①天然耐药性。推测其主要原因为细菌缺乏对该药物灵敏的靶位，或是细菌存在天然的防御导致药物难以顺利进入到细菌体内。②耐药性获得。由于细菌获得了耐药基因，致使先前敏感的细菌成为了耐药菌。检验发现，Hp的耐药主要是获得性耐药，因为根除Hp的指征掌握不完备，Hp根除在诸多消化道不良反应的治疗中存在不恰当的使用，引起抗生素的滥用，使细菌得到耐药基因。统计结果表明，发达地区使用克拉霉素多于发展中地区，因而其耐药率也相应较高，甲硝唑应用较少，耐药水平略低，说明耐药率和药物的使用量成正比。不过，女性患者服用甲硝唑后其耐药率偏高，这与这类人群长期使用甲硝唑用以医治泌尿感染，甲硝唑使用量较高有直接关系。因此，抗生素的频繁使用是引起耐药性提升的关键因素。

1 Hp对硝基咪唑类药物（甲硝唑）耐药机制

甲硝唑的抗菌功效一般是通过以下方式实现的：它的一氧化氮基团于细胞内经过硝基还原酶还原成为羟胺衍生物，该种还原物能引起DNA的损害、断裂等，最终导致细胞的凋亡。甲硝唑的还原活性表达一般是从目标细胞的氧化还原系统中产生的。一旦系统中的还原电位不及甲硝唑时，此系统具有将电子转移给甲硝唑的能力，这时甲硝唑就成为了对细胞存在毒性的物质。甲硝唑还原电位为415 mV，若在厌氧菌里，它的负电位能达到-460 mV，因而该类细菌对甲硝唑比较敏感[2]。尽管Hp的培养性质为微需氧，不过甲硝唑对Hp的功用类似于对厌氧菌的作用。临床医学证实，Hp对甲硝唑有极高的耐药率，但它的作用机制目前尚不清楚，现阶段有关Hp对甲硝唑耐药机制有下列几种论点：

1.1 rdxA的基因突变

不少学者均认为Hp的耐药和rdxA的基因突变有关系。rdxA的基因长度为630 bp，若发生突变会促使蛋白的正常翻译提前结束，进而导致硝基还原酶失去活性。该过程也在DNA转化、聚合酶链反应中被发现。实验还表明，存在于甲硝唑耐药菌株的基因，rdxA拥有更明显的突变率。不过，有研究也认为Hp对甲硝唑的耐药性并不是完全因为rdxA基因的突变[3]。在检验时也发现甲硝唑耐药的Hp菌株中有尚未发生突变的rdxA基因。使用rdxA基因突变引起的甲硝唑耐药菌株只呈现出中等层级的耐药，仅用rdxA基因的突变难以说明分离的耐药菌株里有不同的耐药层级。以往的实验一直未能发现存在特别的核苷酸序列和Hp的耐药表型存在关联，在甲硝唑的菌株中同样有rdxA的基因突变[4]。

1.2 frxA、frxB中的基因突变

甲硝唑产生药理功效是需要经过细胞内部氧化还原体系实现甲硝唑还原。无论在厌氧菌还是微需氧菌中，硝基还原酶不仅有rdxA蛋白，还涵盖了frxA、frxB。不仅如此，在上述两种菌种中，其直接的电子供体均源自frxA、frxB，由于其作用使细胞内的电位>-415 mV。在各种硝基还原酶基因中，rdxA、fdxB、frxA基因突变除外，另外的硝基还原酶突变均对细胞有致死作用。研究表明，frxA、fdxB发生突变时，会引起甲硝唑敏感菌和耐药菌的MIC上升。若已失去活性的基因已进frxA入甲硝唑敏感菌中，此种菌会立即转化为耐药菌，相反情况也是如此[5]。对大肠杆菌的转化也能够得出相同的结论，因此有理由认为frxA、fdxB基因突变对甲硝唑的耐药性有一定作用。不过，在不包含rdxA基因突变的frxA对Hp甲硝唑耐药作用方面尚存较大争议[6]。

1.3 甲硝唑摄入量降低或主动排出量上升

由于Hp为革兰阴性杆菌，它的外膜在一定程度上可阻碍疏水性药物的通透性。甲硝唑则为硝基类药物，是一种疏水性药，没有办法穿透膜的阻碍而顺利扩散到细胞内部。相关咪唑类化合物可对甲硝唑形成抑制作用，提示甲硝唑可能采取了易化扩散的形式最终到达Hp体内。膜耐药是否也参与了甲硝唑的耐药机制呢？有学者[7]发现维拉帕米对外排有抑制性，因而可调整耐甲硝唑Hp的MIC，这是其他该拮抗剂无法完成的，因此推测可能是由于限制了Hp膜上的药物泵引起。依据能量联系的形式可将药物外排分为两种形式：其一为次级转运系统，可能受CCCP抑制；另一种为膜转运和ATP的结合，由ATP水解排出细胞内的毒物质。此种转运方式难以被CCCP抑制[8]。有分析指出，使用CCCP等能量抑制剂后，耐甲硝唑Hp细胞内浓度反倒降低，若無第一种转运形式，耐药Hp是否包含P-糖蛋白？维拉帕米可以提升药物外排为条件降低MIC，这和该药物在肿瘤细胞上的功效有相同之处。

2 克拉霉素的耐药机制及检测方案

研究发现，幽门螺旋杆菌对克拉霉素的耐药存在多因素作用，该菌的23SrRNA某些基因腺嘌呤发生突变，转化为鸟嘌呤，另一些则突变为胞嘧啶。前一种突变被认为是幽门螺旋杆菌耐克拉霉素的主要原因。对T2182C突变的发现过程指示基因突变能同时发生2～3个。不过也有学者指出，该突变和克拉霉素的耐药并无直接关联。有分析认为，幽门螺旋杆菌对克拉霉素的耐药还可能受区域、人种、年龄等因素的影响[9]。该菌种对克拉霉素的耐药作用有显著的地域区别，如在伊朗耐药率可达45%以上，而意大利则不足10%。另外，非消化性溃疡患者对克拉霉素的耐药率明显比消化性溃疡患者高。对非甾体类抗炎药物的服用也会增加对克拉霉素的耐药性。此外，饮食结构、是否存在吸烟习惯均会对其耐药率产生影响。对幽门螺旋杆菌耐克拉霉素的检测方案多建立在PCR分子诊断技术上，该技术以耐药基因突变为基础。使用荧光定量PCR能在1 h内发现23SrRNA的突变。联合应用Biprones技术与Realtime PCR能实现非创伤的幽门螺旋杆菌感染检测，提升23SrRNA的点突变，加之FRET技术的引入，可使用溶解曲线对扩增的产物开展分析，在短时间内同时对大环内酯类耐药性与幽门螺旋杆菌感染进行检测。焦磷酸测序法也被证实为一种高效检测幽门螺旋杆菌对克拉霉素耐药的办法[10]。在众多检测方案中，比色法DNA芯片以其成本低、操作便捷、高特异性得到了临床认同，特别在发展中国家的中小医院中。其芯片对野生株及其他位置存在的单点突变均能给予检测。

3 左氧氟沙星的耐药机制及检测方案

幽门螺旋杆菌对喹诺酮类药物的耐药基本是由该类药物耐药决定区突变引起的。目前已检测出13种突变，位于基因gyrA的不同位点上。左氧氟沙星的耐药也是该基因位点突变形成的。gyrB基因于463位点上发生的点突变是耐药的新机制。由于不同环境对抗生素的使用情况和适应证标准的制订方面存在差异，幽门螺旋杆菌对左氧氟沙星也存在地区、年龄等差别[11]。例如其在儿童与成人中有明显差异：儿童耐药率约为8%，成人超过14%。不同地域对该药物的耐药率也不相同，以南、中欧地区最高（18.6%），马来西亚等地区最低（约0%）。对该类药物耐药机制的检测主要集中于突变的基因。常规采用PCR特异性扩增技术，其后进行核苷酸序列测定。有学者利用突变时菌株的溶解温度进行鉴别，能在3～5 h内识别突变。此外，反向杂交PCR线性探针、DNA条带方法学操作方便，能在临床上推广。

4 Hp对β—内酰胺类耐药机制研究

作为一种氨基青霉素，阿莫西林的作用机制为与青霉素结合蛋白（PBPs）进行结合，对细胞壁粘肽合酶进行抑制，进而阻断其合成过程，造成细菌的胞壁形成缺损，使菌体由于膨胀而分裂。它对细菌的致死作用还有引起细菌自溶酶活性水平，若丧失自溶酶的突变株就会呈现出耐药[12]。对β—内酰胺类的耐药，一般是因为水解该类酶或涉及修正青霉素结合蛋白的突变。但对其耐药Hp菌株进行检验并未发现它具备β—内酰胺酶活性，提示Hp并非经合成形成耐药性。PBPs发生突变是引起阿莫西林耐药的基本原因。近年来全世界关于阿莫西林出现耐药性的报道与日俱增，某些地区该药物的耐药率已达到18%。本世纪我国的浙江地区已发现耐阿莫西林的菌株，耐药率约9%。因此，阿莫西林一类药物耐药率的上升会影响Hp根治的进程。

5 Hp对四环素的耐药机制

该药是一种快速抑菌剂。其药理作用为：药物通过细胞外膜蛋白的弥散作用以及利用细胞内膜能量依赖性转移方式渗入细胞内，阻碍氨基酰-tRNA和核糖体的联系，达到控制肽链延伸及蛋白合成的作用。现阶段认为其耐药机制和Hp16SrRNA序列突变存在关联。有研究在一位70岁结肠癌手术患者身上提取到Hp四环素耐药菌株。该患者使用过三种不同Hp治疗方案，前两种分别以阿莫西林、甲硝唑为主，后一种加入了四环素。疗程>1年。活检胃体和胃窦部，均能正常分离同种形态、氧化酶、过氧化酶测试为阳性的菌株[13]。应用E试验对上述药物开展药敏试验，最终显示2个不同部位均存在甲硝唑及四环素的耐药菌株。不过，四环素的耐药机制尚不十分明确。

6 小结

伴随近年来抗生素在去除Hp感染过程中的普遍使用，耐药菌株也在逐年增加，因而Hp的根除受到严峻的挑战。特别是甲硝唑等硝基咪唑类药物的耐药性使其已不适合成为常规治疗方案。医学界正探索设计一种能迅速、准确、操作便捷的检测方法应对，它对今后临床用药的引导有突出的作用。随着基因芯片技术的不断完善，HRM凭借它迅速、成本低、敏感度好、特异性强、可重复性等优势，已在国外形成一种应用于突变扫描及基因分型的遗传学分析法，目前已在一定范围内逐步推广。此二者的临床应用价值较高，是当下研究的热点问题。此外，掌控Hp根治的适应证、提升治疗依从性、联合用药及中西医结合均为当前研究的重点。

[参考文献]

[1] 刘雪芳， 马岚青. 幽门螺旋杆菌对克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星耐药的研究进展[J].胃肠病学和肝病学杂志， 2016， 25（1）：101-104.

[2] Thung I， Crowe SE， Valasek MA. Letter： global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance - unanswered questions. Authors' reply[J]. Alimentary Pharmacology & Therapeutics， 2016， 43（11）：1249.

[3] 汪望月， 陈光兰， 任玲玲，等. 浙江省丽水地区幽门螺杆菌临床分离株耐药性分析[J].浙江临床医学，2016，18（10）：1903-1905.

[4] Hu Y， Zhang M， Lu B， et al. Helicobacter pylori and Antibiotic Resistance， A Continuing and Intractable Problem.[J]. Helicobacter， 2016， 21（5）：349-363.

[5] 孟霞， 劉改芳， 吴婧，等. 河北地区幽门螺杆菌临床分离株的耐药性分析[J]. 中华医学杂志， 2016， 96（4）：270-272.

[6] 张双红， 谢勇， 李弼民，等. 儿童幽门螺杆菌毒力基因与抗生素耐药相关性研究[J]. 临床儿科杂志， 2017， 35（1）：59-63.

[7] 史先芳， 姜宗丹， 张振玉，等. 江苏省南京地区幽门螺杆菌感染及耐药性调查研究[J]. 临床消化病杂志， 2016， 28（4）：206-208.

[8] 林定赛.幽门螺杆菌VacA基因型与耐药性相关性研究[J]. 医学研究杂志， 2018， 47（2）：124-126.

[9] Mnich E， Ibran J， Chmiela M. Treatment of Helicobacter pylori infections in the light of the increase of antibiotic resistance[J]. Post？説py Higieny I Medycyny Dowiadczalnej，2018， 72：143-158.

[10] 李生利. 消化性溃疡患者幽门螺杆菌感染状况及耐药性分析[J]. 临床心身疾病杂志， 2017， 23（6）：121-123

[11] Peretz A， Paritsky M， Brodsky D， et al. RESISTANCE of Helicobacter Pylori TO Antibiotics IN Israel： Past VS P[J]. Harefuah， 2017， 156（10）：642-644.

[12] 李晓芳， 张瑞， 魏华，等. 幽门螺杆菌对克拉霉素耐药机制的研究[J]. 四川医学， 2017， 38（10）：1143-1146.

[13] Boyanova L， Gergova G， Evstatiev I， et al. Helicobacter pylori resistance to six antibiotics by two breakpoint systems and resistance evolution in Bulgaria[J].Infectious Diseases， 2016， 48（1）：56.

（收稿日期：2018-04-13）