刘永华，夏晓虹，唐彤丹，付瑶

大连市中心医院急诊内科病房，辽宁大连 116033

酒精作为一种肝毒素可引起肝损伤，过量或有害的酒精使用已被列为全球死亡和残疾的五大危险因素之一，其所带来的相关问题倍受重视[1]。既往研究表明，氧化应激和细胞凋亡是酒精性肝病发生发展的重要原因[2]。依达拉奉（edaravone，EDA）作为抗氧化剂、自由基清除剂已被应用于临床治疗脑血管等疾病中。近年来，已有研究发现依达拉奉对肝损伤有保护作用[3]。2016年3月—2017年10月，该院以乙醇诱导体外肝细胞损伤为模型进行研究，初步探讨依达拉奉对损伤细胞氧化应激及细胞凋亡的影响，为后续研究及临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 药物与主要试剂

依达拉奉（南京先声，国药准字H20050280，30 mg/20 mL）；DMEM 培养基（美国 Gibco公司）；胎牛血清（美国 Gibco 公司）；MTT （sigma 公司）；AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒（Vazyme公司）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）试剂盒（凯基生物）；Caspase3 ELISA 试剂盒（Elabscience生物科技公司）；TNF-α抗体（武汉博士德公司）；Actin抗体（北京康为世纪生物科技公司）。

1.2 细胞株

L02细胞购自凯基生物，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。

1.3 主要仪器

倒置显微镜（Leica公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；酶标仪（芬兰）；凝胶成像仪（美国 UVP）。

1.4 模型建立及药物干预

选用对数生长期的细胞接种于96孔板中，每孔200 μL，24 h后加入不同浓度乙醇，终浓度0.05～0.8 mol/L，对照组加入DMEM完全培养基。37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，以MTT法测定细胞活力。选用细胞活力降低为正常75%左右的乙醇浓度作为后续实验条件，将细胞接种24 h后加入浓度为25～200 μmol/L依达拉奉，每组8个复孔。

1.5 MTT法检测细胞存活率

处理后的细胞每孔加入MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h后弃去液体，加入DMSO每孔200 μL，充分反应10 min，在酶标仪波长570 nm处检测吸光度（A）值，细胞增殖率=[（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）]×100%。

1.6 SOD、MDA测试

按各试剂盒说明书操作。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

用不含EDTA的胰蛋白酶消化各组细胞，离心、弃上清，PBS洗涤2次，重悬细胞并计数，制成浓度约为1×105cell/mL的细胞悬液，加入1×Annexin结合缓冲液重悬细胞，在细胞悬液中加入5 μL AnnexinⅤ-FITC，轻轻混匀后于4℃避光孵育15 min；添加10 μL PI染色液后轻轻混匀于4℃避光孵育5 min，上机检测细胞凋亡率。

1.8 caspase3含量检测

参照ELISA试剂盒说明书稀释标准品，加样、洗涤、显色、终止，以空白孔调零后，450 nm波长测定各孔吸光度，并根据标准曲线的直线回归方程计算出样品浓度。

1.9 western bolt检测TNF-α蛋白的表达

提取细胞蛋白样品，BCA试剂测定蛋白浓度，制备SDS－PAGE电泳胶，取预染marker和各组蛋白上样电泳、转膜、封闭、孵育，ECL化学发光显色，经自动电泳凝胶成像分析仪采集，并将各组蛋白条带与βactin的灰度值进行比值，分析各组蛋白表达水平。

1.10 统计方法

数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乙醇对肝细胞存活率的影响

MTT实验结果显示，乙醇对肝细胞的生长有抑制作用，且表现出一定的浓度依赖性。当乙醇浓度为0.05 mol/L时，测得OD值较对照组略低，倒置显微镜下进行观察发现少数细胞形态学稍有改变，大部分细胞生长正常；当乙醇浓度为 0.1、0.2、0.4、0.8 mol/L时，测得OD值逐渐降低，镜下观察变圆漂起的细胞及细胞碎片增多。因此，结合MTT结果及倒置显微镜下对细胞的形态学观察，选择乙醇浓度为0.2 mol/L诱导细胞进行后续实验，见表1。

表1 乙醇对肝细胞的增殖率[（±s），%]

表1 乙醇对肝细胞的增殖率[（±s），%]

注：与对照组比较，*P＞0.05#P＜0.05；各乙醇组与前一组比较，P＜0.05。

乙醇浓度（mol/L）24 h增殖率0（对照组）0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 99.82±0.33（97.86±0.77）*（89.73±3.63）#（76.18±3.92）#（64.43±2.47）#（51.11±4.50）#

2.2 依达拉奉干预后肝细胞存活率

不同浓度EDA作用于0.2 mol/L乙醇诱导的细胞24 h后，MTT结果显示，各EDA干预组增殖率均值较乙醇组增高，但25 μmol/L EDA组增殖率较乙醇组差异无统计学意义（P＞0.05），50～125 μmol/L EDA组增殖率较前组比较差异有统计学意义（P＜0.05），150 μmol/L EDA组增殖率较前组比较差异无统计学意义（P＞0.05），200 μmol/L EDA 组增殖率较前组比较有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05），故选用125 μmol/L EDA作为干预浓度，见表2。

表2 依达拉奉对酒精模型组细胞的增殖率[（±s），%]

表2 依达拉奉对酒精模型组细胞的增殖率[（±s），%]

注：与乙醇组比较，*P＞0.05、#P＜0.05。

依达拉奉浓度（μmol/L）24 h增殖率0（0.2 mol/L 乙醇组）25 50 100 125 150 200 73.99±1.89（74.10±1.52）*（76.12±0.85）#（79.11±0.70）#（81.53±0.69）#（81.76±1.07）#（80.35±1.09）#

2.3 SOD活性、MDA含量

结果显示乙醇组SOD水平较正常对照组降低，MDA较对照组升高。与乙醇组比较，EDA干预组SOD水平升高，MDA含量降低，各组间均差异有统计学意义（P＜0.05），见表 3。

表 3 各组细胞 SOD、MDA、caspase3含量及凋亡率比较（24 h）（±s）

表 3 各组细胞 SOD、MDA、caspase3含量及凋亡率比较（24 h）（±s）

注：各组间比较 *P＜0.05。

组别SOD（U/mL） （nmol/mL） Caspase3（ng/mL） 凋亡率（%）MDA正常对照组0.2 mol/L乙醇组125 μmol/L依达拉奉组25.17±1.88（10.65±1.12）*（16.33±2.06）*1.53±0.22（3.68±0.39）*（2.31±0.33）*1.16±0.27（2.89±0.35）*（1.97±0.31）*0.72±0.15（15.68±1.07）*（10.32±0.89）*

2.4 细胞凋亡率

AnnexinⅤ/PI双染法是常用检测凋亡的方法，可区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡及死亡细胞。与对照组相比，乙醇组正常活细胞数减少，凋亡率增高（P＜0.05）；与乙醇组比较，EDA干预组正常细胞比例升高，凋亡率下降（P＜0.05），见表 3。

2.5 依达拉奉对Caspase3的影响

与对照组相比，乙醇组细胞Caspase3含量升高（P＜0.05）；与乙醇组比较，EDA干预组细胞Caspase3活性降低（P＜0.05），见表 3。

2.6 TNF-α蛋白的表达

依达拉奉组TNF-α蛋白水平为 （0.386±0.059），正常对照组 TNF-α蛋白水平为（0.157±0.058），乙醇组 TNF-α 蛋白水平为（0.673±0.061），与正常对照组相比，乙醇组细胞蛋白表达量增加（P<0.05）；与乙醇组比较，EDA干预组细胞蛋白表达减少（P<0.05）（图1）。

图1 各组TNF-α蛋白表达

3 讨论

近年来，全球酒精性肝病患病率呈现持续增长趋势，乙醇摄入体内约90%经肝脏代谢，长期大量饮酒将对肝脏造成损伤，而治疗酒精性肝病所需要的费用远远高于酒精滥用所导致的其他疾病[4]。Zeng W等[5]研究发现依达拉奉对心脑血管等损伤有保护作用，不仅可以清除自由基、抗氧化，还具有抗凋亡、抗坏死、抑制炎症反应等作用，可一定程度上提高肝组织修复能力。

乙醇在体内代谢可发生氧化应激，降低细胞抗氧化能力。Jiang Wen-Ping等[6]提出SOD是重要的抗氧化酶，其活力可反映机体氧化应激情况和清除自由基能力，而MDA是体内重要的脂质过氧化物，可反映细胞过氧化损伤程度，从而反映细胞受自由基损伤程度。在其依达拉奉对肝损伤小鼠的实验中，实验前小鼠MDA水平(3.01±0.35)nmol/mL,SOD活力(23.01±0.57)U/mL,依达拉奉组（4、8、16 mg/kg）的 MDA 水平分别(6.01±0.81)、(4.95±0.35)、(3.74±0.71)nmol/mL，SOD活力分别为(16.45±2.02)、(18.24±0.88)、(19.41±1.09)U/mL，MDA水平明显降低，SOD活力明显升高。结论差异有统计学意义（P＜0.01）。此结论与本实验结果一致，该实验中，依达拉奉干预组SOD活力为(16.33±2.06)U/mL，MDA水平为(2.31±0.33)nmol/mL较乙醇组SOD水平升高、MDA含量降低，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示依达拉奉可能是通过抗氧化应激、清除自由基而对酒精性肝损伤起保护作用。

细胞凋亡是酒精性肝损伤发病的主要机制之一，乙醇可引起脂质过氧化反应，诱导肝细胞凋亡[7]。Caspase家族是细胞程序性死亡的介导者和执行者，在细胞凋亡中扮演重要角色，Caspase-3为凋亡执行因子，位于效应的下游，被凋亡始动因子激活后作用于特异性底物，诱导细胞凋亡的发生[8-9]。该实验中乙醇处理细胞后，正常组Caspase-3含量为(1.16±0.27)ng/mL，乙醇组 Caspase-3 含量为(2.89±0.35)ng/mL，乙醇组较正常组升高，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）说明肝细胞发生凋亡；依达拉奉干预组Caspase-3含量为(1.97±0.31)ng/mL，较乙醇模型组Caspase-3含量减少，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示依达拉奉可能通过抑制Caspase-3途径，降低了乙醇所致的肝细胞凋亡。

TNF-α为一种炎性细胞因子，可导致肝细胞坏死，与酒精性肝损伤的发生发展相关，其能与ROS中间体产生正反馈调节，同时还能刺激其他炎症因子的释放，促使中性粒细胞浸润及脂质过氧化，激活 Caspase蛋白酶通路，诱导细胞凋亡[10]。该文图1中乙醇组细胞TNF-α蛋白表达较正常组显著增加，依达拉奉组TNF-α蛋白表达较乙醇组减少，提示依达拉奉可能通过抗TNF-α表达而减轻细胞炎症反应，进而减少Caspase-3诱导的细胞凋亡。

综上所述，依达拉奉对酒精诱导肝细胞氧化应激损伤及细胞凋亡具有一定的保护作用，但这其中复杂的分子机制仍需要进一步研究。