王冬芮 张永慈 王增光

作者单位：300052 天津医科大学总医院神经外科

脑胶质瘤是颅内最常见的一种恶性肿瘤，约占神经上皮性肿瘤的半数以上，其临床特点为具有高侵袭能力以及高恶性程度，目前对于脑胶质瘤患者标准治疗方法为手术联合放、化疗，但患者5年生存期仍不足5﹪[1]。胶质瘤干细胞（glioma stem cells，BGSCs）是胶质瘤细胞中的一类亚群细胞，具有多向分化、自我更新以及无限增殖的能力[2]。槲皮素是一种类黄酮的小分子药物，具有很强的抗自由基以及抗氧化活性，近些年来，学者研究认为槲皮素具有潜在的抗肿瘤能力，且被多项研究证实[3]。miR- 29s家族包括 miR-29a、miR-29b和 miR-29c，在不同的肿瘤组织中其作用不同，对于脑胶质瘤组织中，miR-29s为抑癌基因，miR-29a和miR-29c可有效抑制胶质瘤细胞增殖、迁移以及侵袭[4]。目前关于miR-29家族与干细胞的行为研究较多，但是关于槲皮素对其生物学行为的影响，尚未见相关报道。本研究探讨分析槲皮素对人脑BGSCs生物学行为及miR-29s家族的影响，现报道如下。

材料与方法

一、主要仪器及试剂

DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），澳洲胎牛血清（美国Gibco公司），FITC-PI凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物股份有限公司），悬浮细胞培养瓶（美国 Corning公司），槲皮素（美国 Sigma公司），CCK-8试剂盒（日本同仁），Real-time PCR试剂盒（ABI公司）。正置显微镜（日本 Olympus），Real- time PCR仪（ABI公司），电泳装置（美国Biorad公司）。

二、方法

（一）细胞培养及BGSCs提取

U87神经胶质瘤细胞株由免疫实验室保存，采用含10﹪胎牛血清的DMEM高糖培养基常规培养，培养条件 5﹪ CO2、37℃，隔 2 ～ 3 d进行 1次传代。取对数生长期细胞，以干细胞培养液制备细胞悬液，将其转移至悬浮细胞培养瓶内培养，2 ～ 3 d换液。干细胞培养液包括：无血清的DMEM/F12培养液，加入20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/ml表皮生长因子（EGF）以及2﹪ B27。

（二）BGSCs分离与鉴定

上述操作连续培养2周后，去悬浮培养瓶内的细胞球作为BGSCs，使用多聚甲醛固定细胞球，PBS清洗后使用10﹪ BSA封闭，封闭30 min，加入CD133（肿瘤干细胞标志物）以及Nestin（神经干细胞标志物）抗体孵育过夜（4 ℃），PBS清晰，FITC标记二抗以及Cy-3标记二抗37 ℃下孵育1 h，PBS清洗，封片，在荧光显微镜下观察，BGSCs细胞球可同时表达CD133以及Nestin，表明在干细胞培养基内所形成的细胞球为典型的BGSCs。此外，目前研究已经针对此方法分离干细胞的分化和增殖能力进行鉴定[5]，本研究未再次进行分化诱导试验。

（三）细胞增殖活性检测

采用CCK-8法进行细胞增殖活性检测，收集悬浮培养瓶中的细胞球细胞，制备BGSCs细胞悬液，以1×104/100 μl细胞数接种于96孔板内，每孔接种100 μl，培养过夜，换用新鲜配置的含有槲皮素的培养液继续培养，槲皮素浓度为 0，10，20，40，80 和160 μg/ml。每个浓度设置5 个复孔，培养24 h、48 h，每孔内加入10 μl CCK-8工作液继续孵育2 h，使用酶标仪测定各孔450 nm波长处各孔光吸收值。

（四）细胞凋亡检测

采用FITC-PI双染法对细胞凋亡进行检测，制备BGSCs细胞悬液，按照1×106/ml浓度接种于6 孔培养板内，培养过夜后，使用含有槲皮素的培养基处理，槲皮素浓度分别为 0，20，40，80 μg/ml，培养48 h后收集细胞，使用PBS洗涤2次。加入70﹪预冷乙醇，在4 ℃条件下固定过夜，离心后使用PBS洗涤，加入500 μg碘化丙啶染液，4 ℃避光孵育半小时，上机检测。

（五）Real-time RCP检测

制备BGSCs细胞悬液，按照1×106/ml浓度接种于6孔培养板内，培养过夜后，使用含有槲皮素的培养基处理，槲皮素浓度分别为0，20，40，80 μg/ml，培养48 h后收集细胞。采用Trizol法提取各组细胞总RNA，参照Takara反转录方法逆转合成cDNA，将其置于-20 ℃冰箱内备用。采用广州复能基因有限公司提供的miR-29a/b/c引物。采用Beacon designer 8.0设计内参U6基因引物，U6上游引物序列为5'-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3'，下游引物序列为5'-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT-3'。引物由上海生工生物有限公司合成。

Real-time PCR 反应体系为：SYBR mix×10 μl，cDNA 2 μl，6 μl dd H2O，上、下 游 引 物 各 1 μl。反 应 条 件：95℃ 预 变 性 3 min，95℃ 变 性 10 s，60 ℃×20 s，共进行40个循环。实验重复3次。

三、统计学分析方法

采用SPSS 22.0统计软件，细胞抑制率、细胞凋亡率以及胞miR-29s家族表达采用± s表示，两组细胞抑制率、细胞凋亡率以及胞miR-29s家族表达比较采用独立t检验，两组以上细胞抑制率、细胞凋亡率以及胞miR-29s家族表达比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、槲皮素对BGSCs细胞增殖的影响

随着槲皮素浓度的增加，BGSCs细胞增殖抑制率增加（P＜ 0.05），且同浓度槲皮素作用48 h对BGSCs细胞增殖抑制率高于作用24 h（P＜ 0.05，表 1）。

二、槲皮素对BGSCs细胞凋亡的影响

槲皮素浓度 0 μg/ml凋亡率（13.42±1.21）﹪、20 μg/ml凋亡率（38.47±9.28）﹪、40 μg/ml凋亡率（59.34±7.20）﹪、80 μg/ml凋亡率（71.42±9.47）﹪，随着槲皮素浓度的升高，BGSCs细胞凋亡率升高（F= 57.493，P＜ 0.05），各组间差异具有统计学意义（表 2）。

表1 不同浓度槲皮素对培养不同时间BGSCs细胞抑制率比较（﹪， ± s）

表1 不同浓度槲皮素对培养不同时间BGSCs细胞抑制率比较（﹪， ± s）

注：与 0 μg/ml比较，*P ＜ 0.05

浓度 24 h 48 h t值 P值0 μg/ml 0.00±0.12 0.09±0.05 1.548 0.160 10 μg/ml 1.36±0.38* 9.84±2.17* 8.607 0.000 20 μg/ml 15.33±3.01* 28.57±3.84* 6.068 0.000 40 μg/ml 29.50±4.57* 43.59±5.21* 4.546 0.002 80 μg/ml 40.21±6.42* 59.50±3.28* 5.983 0.000 160 μg/ml 61.21±7.48* 70.21±9.48* 1.667 0.134 F值 76.273 85.392 - -P值 0.000 0.000 - -

表2 不同浓度槲皮素对BGSCs细胞miR-29s家族表达的影响（ ± s）

表2 不同浓度槲皮素对BGSCs细胞miR-29s家族表达的影响（ ± s）

注：与 0 μg/ml比较，aP ＜ 0.05；与 20 μg/ml比较，bP ＜ 0.05；与 40 μg/ml比较，cP ＜ 0.05

浓度 miR-29a miR-29b miR-29c 0 μg/ml 1.04±0.08 1.06±0.09 1.03±0.07 20 μg/ml 1.16±0.05a 1.13±0.05a 1.15±0.03a 40 μg/ml 1.30±0.10ab 1.25±0.07ab 1.22±0.06ab 80 μg/ml 1.41±0.09abc 1.30±0.09abc 1.31±0.08abc F值 19.281 13.427 14.502 P值 0.000 0.000 0.000

三、槲皮素对BGSCs细胞miR-29s家族的影响

不同浓度槲皮素处理BGSCs细胞后，可促进BGSCs细胞miR-29s家族miR-29a/b/c相对表达量，且随着槲皮素浓度的增加，BGSCs细胞miR-29s家族相对表达量增加（P＜ 0.05，表 2）。

讨 论

脑胶质瘤是中枢神经系统最为常见的一种原发性肿瘤，可造成患者神经系统功能障碍，对患者生活质量及生命安全造成了极大的威胁[6]。手术切除联合放化疗是目前治疗脑胶质瘤的首选治疗方式，但患者治疗后复发率仍然较高且患者治疗预后较差[7]。近年来研究显示[8]，脑胶质瘤细胞具有特异性，而仅仅脑BGSCs具有自我更新及无限增殖能力。研究显示[9]，BGSCs是脑肿瘤组织的其原细胞，同时也是肿瘤转移复发的源泉。因此从理论上来看，只有有效杀灭BGSCs细胞，才能够达到治愈肿瘤的目的。现有研究显示[10]，恶性脑肿瘤分离所获得的BGSCs均表示为CD133染色阳性，因此可将CD133作为脑肿瘤干细胞鉴定的重要标记物；此外，Nestin作为神经干细胞及前提细胞中表达的一种骨架蛋白，Nestin原本是神经干细胞最重要的标志物，而在脑肿瘤干细胞中也有明显表达[11]。因此本研究采用CD133及Nestin作为BGSCs细胞鉴定的标志物。槲皮素作为一种天然的黄酮类化合物，能够从多种植物中提取而来，具有着较强的抗炎、抗氧化、抗衰老以及抗肿瘤作用[12]。目前关于miR-29s家族与BGSCs细胞生物学行为之间的研究较多，但是关于槲皮素对BGSCs细胞生物学行为及miR-29s家族的影响，尚无相关报道。本研究探讨分析槲皮素对BGSCs细胞生物学行为及miR-29s家族的影响。

本研究结果显示，随着槲皮素浓度的增加，BGSCs细胞增殖抑制率增加（P＜ 0.05），且同浓度槲皮素作用48 h对BGSCs细胞增殖抑制率高于作用24 h（P＜ 0.05）。提示槲皮素对于BGSCs细胞具有增殖抑制作用，且其作用呈一定的剂量、时间依赖性。此外，随着槲皮素浓度的升高，BGSCs细胞凋亡率升高（P＜ 0.05），各组间差异具有统计学意义。表明槲皮素可促进BGSCs细胞凋亡，同时其细胞凋亡促进作用与槲皮素浓度具有一定的联系。从上述研究可得知，槲皮素对人脑BGSCs具有抑制作用及促凋亡作用，与槲皮素相关抗肿瘤研究结果相似[13]。

研究显示，在不同肿瘤组织中，miR-29s家族有所不同，甚至在同一疾病中，miR-29s功能也有所不同，但关于BGSCs中miR-29s家族表达及其功能研究尚不明确[14]。研究显示，miR-29a和miR- 29c可有效抑制胶质瘤细胞增殖、迁移以及侵袭能力。本研究探讨分析槲皮素对BGSCs中miR-29s家族表达的影响，结果显示，不同浓度槲皮素处理BGSCs细胞后，可促进BGSCs细胞miR-29s家族miR-29a/ b/c相对表达量，且随着槲皮素浓度的增加，BGSCs细胞 miR-29s家族相对表达量增加（P＜0.05）。结合上述槲皮素对BGSCs细胞抑制及促凋亡作用，分析在人脑BGSCs中，miR-29s家族具有着抑癌作用，这与相关研究结果相似[15]。

综上所述，槲皮素可有效抑制人脑BGSCs增殖，促进人脑BGSCs凋亡，并促进人脑BGSCs中miR-29s家族表达，其具体作用机制，还需要进一步深入研究分析。