董 升,梁晗业,王禹捷,王俊刚,关晓娇,姚月保,徐志立

(辽宁中医药大学药学院,辽宁大连 116600)

车前草为车前科植物车前(PlantagoasiaticaL.)或平车前(PlantagodepressaWilld.)的干燥全草,具有清热、利尿、通淋、祛痰、凉血、解毒等功效,多内服或鲜草捣烂外敷,用于热淋涩痛、水肿尿少、暑湿泄泻、痰热咳嗽、吐血衄血、痈肿疮毒等病症[1-2]。研究表明,车前草主要活性成分有黄酮类、苯乙醇苷类、环烯醚萜类、挥发油、多糖、膳食纤维等[3],具有利尿、镇咳、祛痰、抗炎、缓泻等作用[4]。

车前草多糖是车前草含有的主要活性成分之一,车前草多糖含有α-半乳糖(rhamnogalacturonans)、半乳糖(galactans)、阿拉伯半乳糖(arabinogalactans)及木聚半乳糖(xylogalacturonans)等成分[5]。许多植物多糖具有免疫调节作用[6],研究表明，车前草多糖能显著提高雏鸡抗体效价,促进淋巴细胞增殖,提高雏鸡胸腺、脾脏和法氏囊等免疫器官的脏器指数[7-8];体外细胞培养结果显示，车前草多糖可明显提高细胞免疫能力及抗氧化活性[9-11]。

机体免疫系统主要有三大功能:免疫防御、免疫监视和免疫自稳定。免疫抑制会导致机体防御、识别与清除外来抗原(病原微生物等)和自身抗原的能力下降,难以维持机体生理平衡,导致疾病产生。尽管已有车前草多糖调节免疫功能的研究报道,但仍缺乏对于病理状态动物的整体研究,尤其是对于免疫功能低下动物的缓解治疗作用的研究。

环磷酰胺是一种细胞毒性药物,能杀死有丝分裂和进入循环周期的细胞,具有较强的免疫抑制作用,这种抑制效应体现在减轻免疫器官重量、抑制巨噬细胞活性、抑制T细胞增殖及抗体分泌等各方面,故免疫学研究常以环磷酰胺作为细胞免疫、体液免疫中的免疫抑制模型的诱导药物[12]。本研究采用经典的环磷酰胺诱导免疫功能低下小鼠模型,考察车前草粗多糖对机体免疫力的调节作用,为车前草多糖的深入研究与新药开发提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明种小鼠 SPF级,雌雄各半,体重18～22 g,许可证号:SCXK(辽)2015-0001,辽宁长生生物技术有限公司;车前草 大连市国药大药房,经辽宁中医药大学中药鉴定教研室王添敏副教授鉴定为正品;注射用环磷酰胺 江苏盛迪医药有限公司;盐酸左旋咪唑片 山东仁和堂药业有限公司;2,4-二硝基氟苯 成都艾科达化学试剂有限公司;丙酮国药集团 化学试剂公司;碳酸钠 北京化工厂;苯酚 天津市大茂化学试剂厂;葡萄糖标准品 坛墨质检-国家标准物质中心;注射用印度墨汁 北京诺博莱德科技有限公司,临用前以生理盐水稀释8倍;都氏试剂(Drabkin’s reagent) 使用时1μL都氏试剂以蒸馏水稀释为1000 mL备用,Sigma公司;绵羊红细胞(SRBC) 大连医科大学实验动物中心。

UV-5600型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;TG-16W型台式离心机 长沙湘仪离心机有限公司;MA240D型电子分析天平 上海第二天平仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 车前草粗多糖的提取 参考文献[13]方法。取干燥车前草粉碎,40目过筛,加入蒸馏水浸泡1 h,料液比1∶25 (g/mL),70 ℃恒温水浴浸提1 h后,450 W微波处理4 min,冷却至室温,抽滤,弃去残渣,收集滤液。滤液采用NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液调节pH至5.4～5.6,60 ℃水浴预热(酶解温度),加入车前草粉末质量2%的木瓜蛋白酶,搅拌均匀,60 ℃下恒温振荡器振荡(振荡频率95 Hz)2 h,脱去蛋白,然后置于沸水锅中,沸水浴10 min灭活酶,冷却至室温。将提取液放置到离心管中,4000 r/min离心15 min,取上清液转移到烧杯中,在烧杯中加入1%(m/v)的活性炭进行脱色处理,在恒温振荡器(60 ℃,95 Hz)上吸附40 min,吸附温度调至60 ℃。吸附完成后将溶液转入离心管中,4000 r/min离心15 min,取上清液,抽滤除去活性炭。滤液转移到旋转蒸发仪中,60 ℃浓缩至滤液体积的10%,按浓缩液与乙醇体积比1∶3加入无水乙醇沉淀多糖,搅拌均匀,4 ℃冰箱中静置12 h过夜,抽滤,收集固体产物,真空冷冻干燥(-40 ℃),得到车前草粗多糖。按此方法提取4批,分别计算提取率。

提取率(%)=粗多糖质量/干燥车前草质量×100

1.2.2 车前草粗多糖含量测定 参考文献[14]方法,采用硫酸-苯酚法测定所提取的车前草粗多糖中总糖含量。

标准曲线的绘制:称取干燥至恒重的葡萄糖标准品，配制0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液于具塞试管中,加双蒸水至1 mL,分别加入5%苯酚溶液1.0 mL,混匀,迅速加入浓硫酸5.0 mL,摇匀,静置5 min,30 ℃水浴孵育20 min,静置10 min;另取一试管,分别加入1.0 mL蒸馏水,1.0 mL苯酚与5.0 mL浓硫酸作为空白对照;490 nm波长处测吸光度(A值)。以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。

总糖含量测定:称取烘干的车前草粗多糖,配制为相应浓度,测定吸光度,根据标准曲线计算样品中葡萄糖含量[15]。

车前草粗多糖中总糖含量(%)=(样品溶液中葡萄糖质量×样品溶液的稀释倍数/样品质量)×169

1.2.3 分组及给药 小鼠在清洁级环境中饲养,温度(22±2) ℃,相对湿度40%～60%,控制照明时间为14 h，适应一周后开始实验。各实验均取60只小鼠,随机分为6组,每组10只。分别为正常对照组,免疫低下模型组,车前草粗多糖高、中、低剂量组,左旋咪唑组(阳性对照)。车前草粗多糖高、中、低剂量组分别灌胃给予900、300、100 mg/kg的车前草粗多糖;左旋咪唑组灌胃给予25 mg/kg;正常对照组及模型组小鼠给予等体积蒸馏水。每天一次,连续21 d。

1.2.4 免疫低下模型的建造 在实验结束前10 d(给药第12 d),各组小鼠腹腔注射环磷酰胺注射液80 mg/kg,连续3 d,正常组小鼠腹腔注射等体积生理盐水[16-17]。

1.2.5 车前草粗多糖对免疫低下小鼠炭粒廓清功能的影响 末次给药后120 min,尾静脉注射印度墨水0.1 mL/10 g,注射后选取不同时间(5、20 min),分别从眼眶静脉丛取血25 μL溶于0.1% Na2CO32 mL溶液中,摇匀,在600 nm波长下比色,测定吸光度(A值),解剖小鼠,取肝、脾,称重,计算廓清指数K值和校正廓清指数α值[18-19]。

廓清指数K=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)

式中，A1、A2分别为5、20 min时的吸光度，t1、t2分别为5、20 min。

1.2.6 车前草粗多糖对免疫低下小鼠迟发型变态反应(delayed type hypersensitivity,DTH)的影响 首次给药后第16 d，各组小鼠背部皮肤脱毛后，涂抹0.5%二硝基氟苯丙酮溶液50 μL致敏,第20 d测各组小鼠左后足足趾厚度,然后在测量部位皮下注射0.5%二硝基氟苯丙酮溶液10 μL激发反应,24 h后,用游标卡尺测量各组小鼠左后足趾厚度。每次测量均在同一部位连续测量3次,取平均值。以激发前后足趾厚度差表示DTH反应强度[20-21]。

1.2.7 车前草粗多糖对免疫低下小鼠体重的影响 整个实验过程中每周测定体重2次,判断车前草粗多糖对免疫低下小鼠体重的影响。

1.2.8 车前草粗多糖对免疫低下小鼠血清溶血素水平、胸腺指数与脾脏指数的影响 实验中所用补体按下列方法制备:新鲜豚鼠3只混合血清,1 mL压积SRBC加入到5 mL豚鼠血清中,于4 ℃吸收30 min,5 min轻轻振荡1次,分装,置-70 ℃以下备用,用时以生理盐水液按1∶10稀释,即配制为10%补体。

在首次给药后第16 d,小鼠腹腔注射5% SRBC 0.2 mL/只,连续免疫3 d,免疫后5 d(即给药后第21 d)眼眶后静脉丛取血,分离血清,生理盐水稀释血清300倍;取1 mL稀释后的血清依次加入反应管内,再加5% SRBC 0.5 mL、10%补体1 mL,置37 ℃水浴孵育30 min,移至冰浴终止反应;1500 r/min,4 ℃离心5 min,取上清液1 mL,加入3 mL都氏试剂,混匀,10 min后用分光光度计(540 nm)比色读取OD值;取同实验用的5% SRBC 0.25 mL,加入4 mL都氏试剂,10 min后在540 nm 处比色读取A值,即为试验中所用SRBC半数溶血时的A值[22]。

半数溶血值HC50=(样品A值/SRBC半数溶血时的A值)×稀释倍数

于末次实验后，解部出胸腺及脾脏，分别称量，计算各组小鼠胸腺指数与脾脏指数。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 车前草粗多糖提取率及总糖含量

通过不同浓度葡萄糖标准液的OD值,绘制标准曲线为Y=5.0343X+0.0013(R2=0.9999),然后计算得出4批次的车前草粗多糖的平均提取率为6.17%±0.63%。将其中提取率较高的3批车前草粗多糖均匀混合,测得总糖含量为(236.60±1.22) mg/g。

2.2 车前草粗多糖对免疫低下小鼠炭粒廓清功能的影响

机体免疫系统中,巨噬细胞是最先对抗原产生反应的免疫细胞之一,其吞噬功能反映机体的非特异性免疫功能[23]。而廓清指数K值和校正廓清指数α值可直观反映巨噬细胞的吞噬功能。

由表1可知,与正常组比较,模型组小鼠的廓清指数K值和校正廓清指数α值极显著降低(p<0.01),表明模型组小鼠的炭粒廓清功能极显著下降(p<0.01),实验建模成功;与模型组比较,车前草粗多糖高剂量组、左旋咪唑组小鼠的廓清指数K值和校正廓清指数α值极显著升高(p<0.01),而车前草粗多糖的中、低剂量组对此两指标无显著性影响(p>0.05)。由此可知,适宜剂量的车前草粗多糖可明显提高免疫低下小鼠的非特异性免疫功能。

表1 车前草粗多糖对免疫低下小鼠炭粒廓清反应的影响Table 1 Effects of crude polysaccharides from Plantago asiatica L. on the carbon clearance reaction in immunosuppressed mice

2.3 车前草粗多糖对免疫低下小鼠DTH反应的影响

DTH是检测T细胞功能的体内实验方法之一,通过测定受试物对机体DTH反应的影响,可反应机体的T细胞功能或受试物的作用。由表2可得,与正常组相比,模型组小鼠的足趾厚度差极显著减少(p<0.01),即DTH反应强度极显著降低(p<0.01);与模型组相比,高、中剂量的车前草粗多糖以及左旋咪唑(25 mg/kg)会使免疫低下模型小鼠的足趾厚度差极显著增加(p<0.01),而低剂量的车前草粗多糖虽对其也有增加作用,但并不显著(p>0.05)。由此可知,适宜浓度的车前草粗多糖后可明显增加免疫低下模型小鼠的足趾厚度差,即可增强模型小鼠DTH反应强度。

表2 车前草粗多糖对免疫低下小鼠迟发型变态反应的影响Table 2 Effects of crude polysaccharides from Plantago asiatica L. on the DTH in immunosuppressed mice

2.4 车前草粗多糖对免疫低下小鼠体重的影响

给予环磷酰胺后,小鼠免疫功能受到抑制,同时伴有体重减轻[24]。表3结果显示,注射环磷酰胺前(给药第12 d),与正常组相比,各组小鼠体重均无显著性差异(p>0.05),表明车前草粗多糖的3个剂量和左旋咪唑对小鼠体重无明显影响;给药第12 d注射环磷酰胺后,小鼠免疫功能开始受到抑制,给予环磷酰胺9 d后(给药第21 d),与正常组相比,模型组小鼠体重极显著下降(p<0.01),而灌胃车前草粗多糖(高、中、低)和左旋咪唑(25 mg/kg)后,小鼠体重下降受到抑制,与正常组无显著性差异(p>0.05),表明车前草粗多糖对免疫低下小鼠体重的减轻具有一定程度的缓解作用。

表3 车前草粗多糖对免疫低下小鼠体重的影响Table 3 Effects of crude polysaccharides from Plantagoasiatica L. on the body weight in immunosuppressed mice

2.5 车前草粗多糖对免疫低下小鼠溶血素水平、胸腺指数与脾脏指数的影响

经绵羊红细胞(SRBC)免疫反应后,小鼠的淋巴细胞产生抗SRBC抗体(溶血素),可通过测定在体外溶血反应中释放的血红蛋白表示免疫小鼠血清中溶血素含量,反映机体特异性体液免疫功能。

表4结果显示,与正常组小鼠比较,模型组小鼠溶血素水平极显著下降(p<0.01);与模型组相比,高、中剂量的车前草粗多糖可极显著提高免疫低下小鼠溶血素水平(p<0.01),且强于左旋咪唑(25 mg/kg)(与模型组相比,差异显著(p<0.05)。由此可知,适量的车前草粗多糖对机体特异性体液免疫功能的恢复有明显促进作用。

脾脏和胸腺都是人体重要的免疫器官,胸腺对维持细胞免疫和调节免疫反应起重要的作用[25]。免疫器官的重量是反映机体非特异性免疫功能的重要且直观的指标，胸腺和脾脏指数能反映免疫器官的发育和免疫细胞的功能状况,其数值高低客观反映机体的非特异性免疫能力的大小。表4结果可见,与正常组相比，模型组小鼠注射环磷酰胺后,脾脏和胸腺发生萎缩,脾脏指数与胸腺指数极显著降低(p<0.01);与模型组相比，灌胃高剂量车前草粗多糖和左旋咪唑均可极显著升高免疫低下小鼠的脾脏指数及胸腺指数(p<0.01),中剂量车前草粗多糖可显著升高免疫低下小鼠的脾脏指数及胸腺指数(p<0.05),而低剂量车前草粗多糖虽可升高免疫低下小鼠的脾脏指数及胸腺指数,但作用不显著(p>0.05)。由此可知,适宜剂量的车前草多糖可对抗环磷酰胺引起的脾脏和胸腺的萎缩。

表4 车前草粗多糖对免疫低下小鼠溶血素水平、胸腺和脾脏指数的影响Table 4 Effects of crude polysaccharides from Plantago asiatica L. on hemolysin level,thymus and spleen index in immunosuppressed mice

3 结论

本研究考察车前草粗多糖对免疫抑制小鼠的免疫增强作用,研究发现,适宜浓度的车前草粗多糖能明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠炭粒廓清能力(非特异性免疫指标),对免疫抑制小鼠的DTH反应(特异性免疫指标)具有一定刺激作用,可明显提高免疫抑制小鼠的半数溶血值(特异性免疫指标),增加血清中抗体水平,对环磷酰胺引起的脾、胸腺萎缩具有抑制作用。综上所述,车前草粗多糖对于环磷酰胺所致免疫抑制小鼠的非特异性、特异性体液免疫及特异性细胞免疫功能均具有增强作用,可能对于临床免疫功能低下相关性疾病具有良好的治疗效果,但对于其相关机制还需进行进一步的研究。