陈剑松，周海云

(1.中山大学生命科学学院，广东 广州 510275；2.中山大学测试中心，广东 广州 510275)

磷脂(phospholipids)是生物膜的主要组成成分，存在于真核生物和原核生物体内[1]。磷脂在细胞调控以及辅助因子方面起着重要的作用[2-4]，它们与人体的多种疾病，如癌症[5]、阿尔茨海默病[6]、糖尿病[7]等息息相关。磷脂组学作为阐述磷脂生物学意义的一种方法，其中化合物的提取、分离与检测是分析流程的关键步骤[8]。研究者们提出许多不同的脂类提取方法，其中最典型的是两相萃取法和单相沉淀法。基于Folch等[9]和Bligh等[10]报道的“金标准”法，赵素敏等[11]对血浆中的磷脂进行提取，其步骤可概括为甲醇沉淀蛋白、氯仿萃取磷脂、静置孵化、添加水相诱导分层、移取有机相、减压蒸干并复溶有机相。然而，氯仿具有剧毒性、致癌性和受管控等缺点，Matyash等[12]报道的MTBE法中采用甲基叔丁基醚作为氯仿的替代试剂提取磷脂，但不可避免的是，两相萃取法的操作繁琐、时间成本高，不利于高通量组学分析。为了建立一种高效稳健的脂类提取方法，Sarafian等[13]对单相沉淀法和两相萃取法进行了综合分析，总结出单相沉淀法较两相萃取法省时简便，同时提出异丙醇是一种脂质种类覆盖率较优的提取溶剂；Satomi等[14]使用醇类溶剂对小鼠全血进行提取，该方法表明，醇类溶剂对中性甘油酯的提取效率整体优于乙腈。因此，单相沉淀法相比于两相萃取法省去了分层、干燥与复溶的步骤，大大节约了分析时间，但上述研究都没有提出适合磷脂分析的有效提取方法与分离条件。尽管Zhao等[15]和Zhu等[16]分别报道了采用甲醇或异丙醇沉淀蛋白对全血或血清磷脂进行分析的方法，但未对其他有机溶剂进行考察。

本研究拟采用时间成本低、高通量的单相沉淀法对单相提取溶剂进行优化，基于超高效液相色谱-串联四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)，优化选择适用于磷脂分析的流动相，并结合超声波辅助萃取手段[17-18]，选择适用于磷脂的提取溶剂，建立一种简便、高效的磷脂前处理分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器

Acquity I-Class型超高效液相色谱仪、SYNAPT G2-Si HDMS离子淌度四极杆-飞行时间质谱仪：美国Waters公司产品；Milli-Q超纯水处理系统：美国Millipore公司产品。

1.2 主要材料与试剂

小鼠血清：购自中科晨宇(北京)贸易有限公司，于-20 ℃冷冻贮藏。

乙腈、甲醇、异丙醇：均为色谱纯，美国Thermo Fisher公司产品；甲基叔丁基醚：色谱纯，德国Merck公司产品；甲酸：质谱纯，美国Sigma-Aldrich公司产品；超纯水：由Milli-Q系统制备。

1.3 实验条件

1.3.1样品预处理 向0.1 mL小鼠血清中加入0.5 mL 4 ℃预冷的溶剂系统(分别为甲醇-乙腈(1∶9，V/V)、甲醇、甲醇-甲基叔丁醚(1∶3，V/V)、甲基叔丁基醚)，超声2 min，于-20 ℃静置10 min，在4 ℃下，以12 000 r/min离心15 min，等量(100 μL)移取上清液，挥干后以0.1 mL甲醇复溶，每组测定5个平行样。

1.3.2色谱条件 Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；柱温38 ℃；进样量1.0 μL；流速400 μL/min；流动相：A为超纯水(含0.1%甲酸)， B为含0.1%甲酸的乙腈-异丙醇溶液(50∶50，V/V)；梯度洗脱程序：0～1 min(5%～25%B)，1～6 min(25%～60%B)，6～15 min(60%～90%B)，15～17 min(90%～95%B)，17～20 min(95%～98%B)，20～22 min(98%B)，22.1～25 min(5%B)。

1.3.3质谱条件 ESI模式参数：毛细管电压±2.5 kV；雾化气和锥孔气为氮气；雾化气压强0.6 MPa；锥孔电压40 V；反向锥孔气流速40 L/h；离子源温度110 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流速700 L/h。质谱采集为MSE模式；质量扫描范围m/z50～1 500；扫描时间0.3 s；MS/MS Trap高能碰撞能量25～60 eV。

Lock mass校正液为1 μg/L亮氨酸脑啡肽(556.277 1(+)/554.261 5(-))，数据采集过程中并行采集。

1.3.4数据处理 利用MasslynxV4.1软件(Waters, USA)采集原始数据，通过将原始数据导入Progenesis QI(Nonlinear Dynamics, Waters, UK)软件进行滤噪、峰匹配、峰提取操作后，采用EZinfo 3.0 for Waters(Umetrics, Sweden)软件进行多元统计分析。磷脂化合物鉴定分析基于磷脂裂解规律[19]与在线数据库METLIN[20]metabolite MSMS database(http:∥metlin.scripps.edu)和LipidMaps[21](http:∥www.lipidmaps.org)，通过高分辨质谱采集的精确质量数及其二级离子碎片进行化合物确认。

2 结果与讨论

2.1 流动相系统对磷脂分离的影响

磷脂化合物由溶血性磷脂与磷脂组成，随着分子质量及饱和度的增加，它们在反相色谱柱上的保留时间增长，这要求溶剂的洗脱能力增强。用于脂质组学分析的反相色谱法的流动相系统通常为乙腈-异丙醇溶液(1∶9，V/V)[13,22-23]，该系统可有效地分离总脂，但对于溶血性磷脂而言，洗脱能力过强，会导致其共流出而形成多成分峰。因此，为了更好地分离溶血性磷脂与磷脂，本研究以H2O为流动相A，探讨乙腈[24]、乙腈-异丙醇(95∶5，V/V)、乙腈-异丙醇(50∶50，V/V)3组不同的流动相B对磷脂的分离效果，其中A、B两相均含0.1%甲酸，所得色谱图示于图1。可见，乙腈组可以洗脱极性较大的溶血性磷脂，但对于大分子质量磷脂的分离与洗脱表现不佳，在柱上残留严重，多次重复测试后，磷脂残留叠加，使得样本之间交叉污染，鉴定结果为假阳性，不利于后续多元统计分析；对于大分子质量磷脂，乙腈-异丙醇(95∶5，V/V)组比乙腈组的分离能力强，但在保留时间17～18 min内的2个色谱峰为多组分峰；乙腈-异丙醇(50∶50，V/V)组不仅能够有效地分离溶血性磷脂，同时对大分子质量磷脂表现出较好的分离能力和洗脱效果，比乙腈-异丙醇(95∶5，V/V)组能够更有效地分离多组分峰，并且避免了分离不充分带来的样本间交叉污染。重现性是大批量样品分析的前提，因此选择乙腈-异丙醇(50∶50，

注：a1.乙腈；a2，b2. 乙腈-异丙醇(95∶5，V/V)；a3，b1.乙腈-异丙醇(50∶50，V/V) 图1 不同流动相组成分离磷脂化合物的基峰色谱图(a)和局部放大图(b)Fig.1 Base peak intensity chromatograms (a) of different mobile-phase and partial enlargement (b)

V/V)组进行重现性考察，连续进样5针后，随机选取多组峰的保留时间及峰面积计算RSD值。结果表明，保留时间RSD值均小于0.1%，峰面积RSD值均小于10%，说明该方法的重现性较好。本实验最终确定流动相A为含0.1%甲酸水溶液，B为含0.1%甲酸的乙腈-异丙醇溶液(50∶50，V/V)。

2.2 血清预处理条件优化

2.2.1血清预处理溶剂系统 本研究采用甲醇-乙腈(1∶9，V/V)(a)、甲醇(b)、甲醇-甲基叔丁醚(1∶3，V/V)(c)、甲基叔丁基醚(d) 4种不同溶剂系统进行血清磷脂化合物的提取，在正、负离子模式下，获得的典型脂质化合物的热图示于图2a、2b。由图可见，由于d组采用极性较弱的甲基叔丁基醚作为提取溶剂，相对于a、b、c组而言，有较高的甘油酯与长链脂肪酸提取效率，但不适合提取磷脂化合物；a组对磷脂化合物覆盖率较b、c组高，同时又能很好地去除干扰性非磷脂类化合物，如甘油酯与脂肪酸。

为了探讨4种提取溶剂系统提取结果的差异性与重复性，对不同处理方法所得的数据矩阵进行主成分分析，其得分图示于图2c、2d。在正离子模式下，可明显地观察到不同的溶剂系统存在差异性，其中以d组与其他溶剂组的差异最为明显；在负离子模式下，组间差异显示，a、b、c三组无显著区别，但d组与其他溶剂组的差异很明显；结合正负离子模式，a组相对于其他溶剂组更为聚集，表明该组重现性较其他溶剂组更佳。正、负离子模式下的载荷图示于图2e、2f，由图可见，在正离子模式下，靠近d组的离子主要为弱极性化合物甘油酯类等，而靠近其他组的离子主要为磷脂化合物；在负离子模式下，靠近d组的离子相对减少，化合物主要集中在a、b、c三组，表明这三组溶剂系统提取磷脂化合物的效率高于d组。从方法简便性的角度考虑，采用a、b两组可省去干燥、复溶两大步骤，避免了磷脂成分损失。综上，本研究选择了方法简便、重复性良好和磷脂提取效率较高的甲醇-乙腈作为血清预处理溶剂系统。

2.2.2超声辅助提取时间 涡旋和超声同样有助于化合物的提取，但长时间的涡旋相比于短时间的超声提取效率并无显著性差异，且增加了时间成本[17-18]。超声辅助提取的时间长短同样影响着提取结果，分别对提取时间为2、10、30 min进行考察，每组测定5份平行样。将所得数据矩阵进行PCA分析，结果示于图3。可见，超声时间的延长并未带来提取效率的显著性差异，对于磷脂的提取而言，超声2 min足以提取充分，且时间成本低，有助于高通量分析。

注：a.正离子模式下典型脂质化合物的热图；b.负离子模式下典型脂质化合物的热图； c.正离子模式下的得分图；d.负离子模式下的得分图；e.正离子模式下的载荷图；f.负离子模式下的载荷图； A.甲醇-乙腈(1∶9，V/V)；B.甲醇；C.甲醇-甲基叔丁基醚(1∶3，V/V)；D.甲基叔丁基醚 图2 不同溶剂系统对磷脂化合物提取效率的影响Fig.2 Effect of different solvent systems on phospholipids extraction ability

2.3 数据可靠性分析

在运行磷脂组学分析方法的过程中，存在基质以及本底信号的干扰，重现性及稳定性会受到影响。本实验采用模式识别方法(主成分分析)验证该方法的重现性及稳定性[25]。分别移取10 μL 4个不同溶剂提取组样品，混合作为QC组，在分析过程中，对系统进行平衡后(连续进行10次QC样品测试)，每组序列后穿插一次QC样本的测定(n=5)。图2c、2d展示了正负离子模式下的QC样本聚集情况，说明仪器状态稳定，样本重现性良好；正负离子模式下，QC样本在第一主成分t[1]、第二主成分t[2]、第三主成分t[3]的投影结果示于图4。结果表明，QC样本均落在±2SD区间内，而数据可靠性接受区间为±3SD，因此，该方法稳定性良好，可用于磷脂组学的研究。

注：a.正离子模式；b.负离子模式 图3 不同超声辅助提取时间的得分图Fig.3 Scores plots of different ultrasonic times

注：a.正离子模式；b.负离子模式 图4 QC样本在不同主成分的投影分数图Fig.4 Principal component scores plots of QC samples

2.4 应用

优化后的前处理方法：向100 μL血清中加入500 μL 4 ℃预冷的甲醇-乙腈溶液(1∶9，V/V)，超声2 min后于-20 ℃静置10 min，在4 ℃下，以12 000 r/min离心15 min，取100 μL上清液进行测试。为了验证方法的适用性，将该方法用于代谢组学研究中常用的血液样本小鼠血清、大鼠血清、人血清以及与食品质量安全息息相关的鸡禽全血[26]的磷脂分析，结果示于图5。可见，该方法适用于以上不同来源的样本分析，整体上表现为不同的色谱峰形，表明差异性的存在。

采用该方法对临床病人血清样本进行磷脂组学分析，得分图示于图5e、5f。图中QC样本聚集在中心，表明在分析过程中该方法稳定，所得数据可靠，而分散程度较大的临床样本进一步证明了人个体差异大的客观事实，可为获得合适的疾病模型提供初步参考。结合MSE模式、Progenesis QI与数据库LipidMaps，鉴定的磷脂包括PC、PE、PI、PG、PA、PS、SM七大类，在正、负离子模式下的鉴定数目分别为302、626个。

3 结论

基于超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱的磷脂组学分析方法，首先对流动相系统进行确定，其次对小鼠血清预处理条件进行优化，包括提取溶剂系统的选择、超声时间的优化，最后利用本方法进行不同种类血样的磷脂组学分析并对方法的实用性进行验证。结果表明，本方法不仅具有简便、重现性良好、磷脂提取效率高以及时间成本低、高通量的优点，同时还适用于不同种类血样和大批量临床样本的磷脂组学研究。

注：a.小鼠血清；b.大鼠血清；c.人血清；d.鸡禽全血；e.正离子模式；f.负离子模式 图5 不同来源血样的基峰色谱图和临床样本在正负离子模式的得分图Fig.5 Base peak intensity chromatograms of four kinds of blood sample and score plots of clinical sample at ESI+ and ESI- mode