林 强,张 蓉,秦小金,窦唯佳,席筱厚,徐家桥,王景杰

(空军军医大学唐都医院消化内科,西安 710038;*通讯作者,E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2 protein,LRIG2)是跨膜蛋白LRIG家族成员之一,在多种脏器中均有表达,但是在消化道中具体分布特点尚不清楚[1,2]。新近研究表明LRIG2是一种促癌基因,参与调控肿瘤细胞增殖分化,与子宫内膜癌、肺癌、胶质瘤等肿瘤的发生发展密切相关,并可以作为肿瘤预后的指标[3-5],目前尚无LRIG2在消化道肿瘤中作用的相关研究。

还有临床研究表明,LRIG2基因缺陷患者多伴有严重的肠动力障碍和泌尿道动力障碍[6,7],表明LRIG2参与调控胃肠、泌尿道平滑肌运动。但是由于LRIG2在胃肠道中的分布情况尚不清楚,所以LRIG2参与调节胃肠动力的机制至今依然不明。在胃肠中,SIP合胞体是由平滑肌、Cajal间质细胞以及PDGFRα阳性细胞构成的功能复合体，是调控的胃肠动力重要的基本单元[8]。已有研究证实LRIG家族另一成员LRIG1在部分ICC亚型(ICC-DMP或ICC-SM)中表达,并参与调节ICC的发育,基因敲除LRIG1可以导致胃肠蠕动迟缓[9]。因此我们推测LRIG2可能和LRIG1相似,也在SIP合胞体成员中表达,或者与SIP合胞体正常功能的维持密切相关。

为此本研究拟通过形态学和分子生物学方法,研究LRIG2在消化道中的表达情况,尤其是LRIG2和SIP合胞体之间的关系,进而探讨RIG2在胃肠动力调节以及胃肠肿瘤中的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6周龄BALB/c小鼠,SPF级,雌雄各半,体质量18-22 g,由空军军医大学(原第四军医大学)实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(陕)2014-002。

1.2 主要试剂、仪器

兔抗LRIG2(atlas公司,美国),大鼠抗PDGFRα抗体(Abcam公司,美国),大鼠抗c-kit(Abcam公司,美国),小鼠抗GFAP抗体(Sigma公司,美国),Alexa Fluor 594标记驴抗大鼠IgG抗体(Jackson公司,美国),Alexa Fluor 488标记驴抗兔IgG抗体(Jackson公司,美国),Alexa Fluor 594标记的驴抗小鼠IgG抗体(Jackson公司,美国),4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(Invitrogen公司,美国),HRP酶标记的羊抗兔IgG抗体(Santa Cruz公司,美国),兔抗GAPDH抗体(Abcam公司,美国);FV1000激光共聚焦显微镜(Olympus公司,日本);恒冷箱切片机(Leica公司,德国);电泳仪和电泳槽(Bio-Rad公司,美国)。

1.3 胃肠道组织标本制备

将小鼠脱颈处死后剖腹，取胃肠道用0.01 mol/L PBS反复冲洗掉肠腔内容物。将用于制作切片的各节段肠道组织分别浸于4%多聚甲醛固定6-8 h，将固定好的组织置于25%蔗糖溶液，4 ℃浸泡过夜，待组织沉底后，恒冷箱切片机上连续切片，切片厚12 μm，风干，-20 ℃保存备用。将用于制作全层铺片的整段结肠一端结扎，然后从另一端以4%多聚甲醛注入腔内，维持充盈状态，结扎。置入相同固定液中固定10-12 h。实验前去除结扎部分，在解剖显微镜下，剪开肠腔，用镊子依次剥离黏膜、黏膜下层。将制备好的肌层组织剪成适当大小的标本块，置于4 ℃的0.01 mol/L PBS中备用。

1.4 间接法免疫荧光多重标记化学染色

将制备好的肠道组织冰冻切片或者全层铺片用含1%BSA+0.3% Triton的PBS液封闭1 h，加一抗(LRIG2抗体按1 ∶100稀释，PDGFRα抗体按1 ∶200稀释，c-kit按1 ∶250稀释，GFAP抗体按1 ∶500稀释)。一抗孵育12 h(4 ℃)。经PBS漂洗后加二抗(Alexa Fluor 488荧光标记二抗或，Alexa Fluor 594荧光标记二抗均按1 ∶1 000稀释)室温孵育2 h，DAPI衬核。PBS漂洗后，50%缓冲甘油封片，镜下观察组织。

1.5 Western blotting检测LRIG2蛋白在胃肠道的表达水平

用眼科剪将胃、小肠和结肠组织剪碎后加入RIPA裂解液，匀浆器匀浆，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min后吸取上清，用BCA法进行蛋白定量，进行SDS-PAGE凝胶电泳、常规转膜。将转好的PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，再加兔抗LRIG2抗体(按1 ∶500稀释)4 ℃孵育12 h。TBST漂洗。加HRP酶标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h。TBST漂洗后，进行化学发光反应。

1.6 统计学分析

Western blotting条带灰度值用Image pro plus软件测量,采用SPSS19.0统计软件,对数据进行单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LRIG2蛋白在胃肠道的表达水平

用Western blotting法对6周龄小鼠胃、小肠、结肠组织分别进行LRIG2蛋白表达水平半定量检测,结果显示LRIG2在胃、小肠、结肠均有表达,表达水平结肠最高,小肠次之,胃略低(F=15.08,P<0.05,见图1)。

2.2 LRIG2阳性细胞在胃肠道的分布特点

通过对小鼠胃体、十二指肠、空肠、回肠、近端结肠和远端结肠组织冰冻切片进行免疫荧光染色(见图2),结果表明LRIG2阳性细胞广泛分布于小鼠胃、小肠、结肠肠壁中。而且LRIG2阳性细胞主要位于肠道肌间神经丛,在小肠黏膜下层也有LRIG2阳性细胞分布。

图1 LRIG2蛋白在胃、小肠、结肠的表达水平Figure 1 Expression of LRIG2 protein in stomach, small intestine and colon

A.胃体;B.十二指肠;C.空肠;D.回肠;E.近端结肠;F.远端结肠图2 LRIG2阳性细胞(↑)在不同节段消化道分布 (bar=40 μm)Figure 2 LRIG2 positive cells (↑) distributed in different segments of the digestive tract (bar=40 μm)

2.3 LRIG2阳性细胞与肠内胶质细胞的毗邻关系

对小鼠结肠全层铺片LRIG2阳性细胞进行免疫荧光染色结果显示,LRIG2阳性细胞广泛分布于小鼠结肠肌间神经丛中,细胞胞体卵圆形,呈团簇状紧密排列,其形态和肠内神经节类似(见图3)。LRIG2细胞团簇之间有神经纤维样的节间束彼此交联,共同构成网络状结构。而将LRIG2阳性细胞和肠内胶质细胞(标记分子:胶质纤维酸性蛋白GFAP)进行免疫荧光双标,结果显示肠内胶质细胞包绕于LRIG2阳性细胞周围(见图4)。因此,团簇状的LRIG2阳性细胞位于肠神经节内,并很有可能是肠内神经元。

2.4 LRIG2阳性细胞和PDGFRɑ阳性细胞的毗邻关系

图3 肠道全层铺片观察LRIG2阳性细胞(↑)在近端结肠肌间神经丛的分布特点Figure 3 The distribution of LRIG2 positive cells(↑) in the myenteric plexus of the proximal colon by gastrointestinal tract whole-mount preparations

对小鼠结肠全层铺片PDGFRɑ阳性细胞和LRIG2阳性细胞进行免疫荧光双标染色，结果显示：肌间神经丛内PDGFRɑ阳性细胞胞体呈梭形或卵圆形，并有细长突触形成(见图5)。PDGFRɑ阳性细胞构成网络状结构，并和LRIG2阳性细胞团簇密切相邻。同时，未见LRIG2和PDGFRɑ共标。

2.5 LRIG2阳性细胞与Cajal间质细胞的毗邻关系

对小鼠结肠全层铺片Cajal间质细胞(标记分子：c-kit)和LRIG2阳性细胞进行免疫荧光双标染色，结果显示：和PDGFRɑ阳性细胞相似，Cajal间质细胞也呈梭形，有细长突触，构成网络状结构(见图6)；并和LRIG2阳性细胞团簇密切相邻。同时，未见LRIG2和c-kit共标。

A.肠内胶质细胞(GFAP标记) B.LRIG2阳性细胞 C.LRIG2和GFAP双标图4 肠内胶质细胞和LRIG2阳性细胞的毗邻关系 (bar=40 μm)Figure 4 Adjacent relationship between enteric glia and LRIG2 positive cells (bar=40 μm)

A.PDGFRɑ阳性细胞 B.LRIG2阳性细胞 C.LRIG2和PDGFRɑ双标图5 PDGFRɑ阳性细胞和LRIG2阳性细胞和的毗邻关系 (bar=40 μm)Figure 5 Adjacent relationship between PDGFRɑ positive cells and LRIG2 positive cells (bar=40 μm)

3 讨论

临床研究表明,Ochoa综合征是LRIG2基因缺陷所致的先天性遗传病[10],患者多伴有严重的排便和排尿障碍症状[6,7],提示LRIG2可能参与调节胃肠和泌尿道平滑肌运动。而且许多研究已经证实,LRIG2作为促癌基因,参与调控肿瘤细胞增殖分化,与子宫内膜癌、肺癌、胶质瘤等肿瘤的发生发展密切相关[3-5]。鉴于LRIG2在胃肠动力紊乱性疾病和胃肠肿瘤发生发展过程中可能起到重要的调控作用,探究LRIG2在消化道中的分布特点具有重要的意义。

A.Cajal间质细胞(c-kit标记) B.LRIG2阳性细胞 C.LRIG2和c-kit双标图6 Cajal间质细胞和LRIG2阳性细胞的毗邻关系 (bar=40 μm)Figure 6 Adjacent relationship between interstitial cells of Cajal and LRIG2 positive cells (bar=40 μm)

本研究结果表明LRIG2阳性细胞在小鼠胃、十二指肠、空肠、回肠、近端结肠、远端结肠广泛分布,并且主要位于肌间神经丛,在小肠黏膜下层也有LRIG2阳性细胞分布。而且位于胃肠道肌间神经丛内的LRIG2阳性细胞被肠内胶质细胞包绕。已有研究已经证实,肌间神经丛中的肠胶质细胞分布于肠神经节内,并包绕于肠内神经元周围,起到支持和保护作用[11]。故此提示LRIG2阳性细胞很有可能是肠内神经元。同时,LRIG2阳性细胞和PDGFRɑ阳性细胞、Cajal间质细胞网络密切毗邻。

在胃肠道的肌间神经丛中,Cajal间质细胞、PDGFRɑ阳性细胞均为间质细胞，与肠内神经元相毗邻,二者形成的细胞突触和神经纤维密切伴行,并接受神经纤维释放的神经递质,参与肠神经肌肉信号传递。肠内胆碱能兴奋性运动神经元可以释放兴奋性神经递质乙酰胆碱,作用于Cajal间质细胞膜上的M受体,促进Cajal间质细胞膜上钙激活氯通道anoctamin-1进一步激活,导致自发性瞬时去极化增强,由此Cajal间质细胞产生慢波的频率和幅度增强;慢波通过缝隙连接使相邻的平滑肌去极化,激活平滑肌细胞L-型钙通道,引起平滑肌收缩[8,12]。肠内嘌呤能神经元可以释放抑制性神经递质(比如ATP)作用于PDGFRα阳性细胞膜上P2Y1受体进而激活小电导钙激活钾通道(small conductance Ca2+-activated K+channel,SK3),SK3通道激活后则会引起自身的超极化,并通过缝隙连接使相邻的平滑肌超极化,抑制平滑肌L-型钙通道开放,引起平滑肌舒张[13,14]。因此,将平滑肌、Cajal间质细胞和PDGFRα阳性细胞这一功能复合体称为SIP合胞体(SIP syncytium)[8]。凡是能影响肠内神经元和SIP合胞体之间以及SIP合胞体内部的信号传导的因素,均有可能对肠道动力产生影响。

本研究形态学结果已经显示LRIG2分布于肠神经节内,并且LRIG2阳性细胞和SIP合胞体密切毗邻。已有研究证实,LRIG2和神经突触形成与再生密切相关[15]。同时临床研究证实,先天性LRIG2基因缺陷的患者胃肠道和泌尿道平滑平滑肌收缩舒张功能异常:患者常出现先天性膀胱排尿功能障碍,同时66%LRIG2基因缺陷患者伴有便秘以及33%伴有大便失禁,还有部分患者出现经口摄食困难[6,7]。上述这些研究表明,LRIG2基因缺陷很有可能导致肠内神经节内的神经元突触形成异常,进而导致肠神经节和SIP合胞体之间的信号传递异常,最终引起胃肠动力紊乱。因此,LRIG2是维持正常胃肠蠕动的重要因素,并可以作为研究胃肠动力紊乱性疾病的切入点。

LRIG家族成员和酪氨酸激酶型生长因子受体信号通路密切相关[16]。其中LRIG1是胃肠道间充质干细胞标志物,参与调控干细胞增殖分化,并与多种胃肠道肿瘤有关[17]。LRIG2作为LRIG家族成员之一,蛋白结构和LRIG1相似,也参与调控EGFR、PDGFR等酪氨酸激酶型生长因子受体信号通路[3,4,18,19]。而EGFR、PDGFR信号通路过度激活和胃肠道腺癌、胃肠道间质瘤等胃肠道肿瘤密切相关[20,21]。本研究证明,LRIG2在胃肠道中确实广泛分布。因此,LRIG2可能参与胃肠道某些肿瘤的形成和发展过程。

通过探究LRIG2在胃肠道分布特点并结合新近研究结果,LRIG2作为调控胃肠运动以及细胞增殖的重要分子,可以作为研究胃肠动力紊乱性疾病以及胃肠道肿瘤的新靶点。