韦 慧,曹贤明,李昱龙,涂中华,樊 奔

(南京林业大学南方现代林业协同创新中心;南京林业大学林学院,中国江苏南京210037)

从激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)中分离的Pfu DNA聚合酶是一种在DNA复制中起聚合作用的蛋白质[1]。国内外已有的研究表明,Pfu聚合酶热稳定性强,有 5′→3′聚合酶活性和 3′→5′外切核酸酶活性[2,3],但不具有5′→3′的外切核酸酶活性,可以在催化聚合反应的同时,纠正聚合反应过程中错误掺入的碱基。因此,Pfu聚合酶具有高保真的DNA聚合活性,在PCR反应中的突变率仅为2.6%[4],是所有热稳定聚合酶中最精确的聚合酶之一,在目前的DNA扩增和测序方法中具有重要作用[5,6]。

目前,国内外研究中所使用的Pfu DNA聚合酶主要从各商业公司购置,对于进行大量分子克隆的实验室来说,这显然是一个不小的科研成本负担。事实上,Pfu聚合酶的基因已被克隆并可异源表达[7],而大部分分子生物学实验室充分具备自主生产Pfu酶的条件,如果有一套详尽可行的制备方案,研究者在实验室自主生产Pfu酶,可以大大节省科研成本。遗憾的是,尽管国内外已有少量关于Pfu酶制备的文章发表,但是由于这些文章的研究重点各不相同,均未对整个制备过程进行详细描述,蛋白质纯化过程中的一些关键细节也就无从借鉴,或者个别条件参数多有抵触,最佳条件莫衷一是。针对这种情况,本研究在蛋白质制备基本方案的基础上,从头摸索,对Pfu酶分离纯化过程中的重要条件参数一一进行了优化确认,从而建立了一套细致可靠的Pfu制备方案。……