程文栋 张娜

(青海省人民医院呼吸科，青海 西宁810007)

慢性阻塞性肺疾病(Acute Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，AECOPD)常由细菌、病毒、环境污染物等诱发，并导致气道炎症及损伤。气道表面上皮细胞损伤后反应包括上皮细胞完整性的破坏、部分脱落，甚至是基底膜的完全脱落。随后上皮修复、再生并恢复功能，其机制涉及上皮基底细胞的迁移、上皮细胞的增殖与分化等。探讨支气管上皮细胞在AECOPD发生中的功能改变，对于AECOPD发病机制的研究十分重要。为研究CEACAM1对支气管上皮细胞功能的影响，本实验探讨CEACAM1对HBE细胞的增殖、迁移以及炎症因子产生等方面的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞系：人支气管上皮细胞株HBE来自中国科学院细胞库。主要试剂：IFN-γR&D Systems 公司；siRNA-CEACAM1GenePharma公司；siRNA-NCGenePharma公司；lipofectamin2000Invitrogen公司；Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco公司；RPMI-1640培养基Hyclone 公司；二甲亚讽(DMSO)Sigma公司；Trizol ReagentInvitrogen公司 ；DNase (RNase Free) water Invitrogen公司Sangon 公司 ；PrimeScript RT reagent KitTaKaRa公司；SYBR Premix Ex TaqTaKaRa公司；引物合成Sangon 公司；CCK-8试剂盒Beyotime 公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 siRNA转染 HBE细胞 转染方法按Lipofectamine 2000产品说明书进行。转染前1天进行细胞铺板，将1×105个HBE细胞接种于24孔板(6孔板4×105个)，每孔内加入 500μl(6 孔板 2ml)无抗生素的 1640 培养基。Lipofectamine2000轻轻摇匀。按照每孔取1μl(6孔板4μl)Lipofectamine2000加入 50μl(6孔板 200μl)Opti-MEM I Reduced Serum Medium比例稀释，轻轻混匀后，室温孵育5min。按照每孔2μl(6孔板8μl)siRNA加入 50μl(6孔板 200μl)Opti-MEM I Reduced Serum Medium比例稀释，轻轻混匀后。5min后，将稀释的Lipofectamine2000 与稀释的 siRNA混合，轻轻混匀，室温静置20min，以形成siRNA-转染试剂混合物。将 siRNA-转染试剂混合液加入含细胞及培养液的孔内，轻轻摇晃孔板混匀。置于37℃、5%CO的培养箱中培养，6小时后更换为含血清的1640培养基。

1.2.2 Real-time PCR PCR检测引物如下：CEACAM1：Forward Primer：5’-GCTGGCATTGTGATTGGAGTA-3’；Reverse Primer：5’-TTAGGTGGGTCATTGGAGTG-3’；IL-6：Forward Primer：5’-GACAGCCACTCACCTCTTCAG-3’；Reverse Primer：5’-CATCCATCTTTTTCAGCCATC-3’；IL-8：Forward Primer：5’-TTGCCAAGGAGTGCTAAAGAA-3’；Reverse Primer：5’-GCCCTCTTCAAAAACTTCTCC-3’；MCP-1：Forward Primer：5’-AGGAACCGAGAGGCTGAGA-3’；Reverse Primer：5’-GGAATGAAGGTGGCTGCTAT-3’；TGF-β：Forward Primer：5’-GCCAGAGTGGTTATCTTTTGATG-3’；Reverse Primer：5’-AGTGTGTTATCCCTGCTGTCAC-3’；VEGF：Forward Primer：5’-AGGGCAGAATCATCACGAAGT-3’；Reverse Primer：5’-AGGGTCTCGATTGGATGGCA-3’。具体实验步骤严格按照试剂盒说明进行。

1.2.3 细胞划痕试验 HBE细胞培养于24孔板，转染 siRNA并用IFN-γ刺激24小时后，观察细胞达完全汇片。……