郭 羽，王 晓

（山西中医药大学，山西晋中030619）

肠道菌群约占人体总微生物量的78%，他们参与了人体的营养、免疫、代谢调节等诸多生理活动，被称为“人体的第二基因库”。近年来随着广谱和强力抗生素的广泛使用，虽然感染性疾病在某种程度上得到了控制，但抗生素在杀死病原菌的同时也杀死了有益菌群，严重破坏了人体肠道的微生态平衡，导致菌群结构和功能失调，进而引起糖尿病、肥胖、心脑血管疾病、结直肠癌等许多相关疾病［1］。因此，肠道菌群与人体健康息息相关，而如何维持肠道菌群的良好状态成为医学界许多学者关注的课题。

益生菌在肠道内大量繁殖可调节紊乱的肠道菌群结构并提高机体免疫力，进而帮助恢复健康水平。所以，有意增加人体肠道内益生菌数量就显得非常重要［1］。鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）是人体肠道中重要的有益菌，肠道黏着率高，定植能力强，具有平衡肠道菌群、排除毒素、抑制有害菌生长、提高机体免疫力等生理保健功能［2］。正因为LGG有如此重要之健康促进功能，很多益生菌制剂都以其作为重要活菌成分。但鼠李糖乳杆菌真正在人体发挥功效，需保证一定数量的菌体经过人体消化道，安全到达肠道。尽管鼠李糖乳杆菌相对于其他益生菌更能耐受消化道的酸性环境，但在经过低pH的胃酸以及受到小肠高浓度胆盐毒害时依然会遭到严重破坏或其活性受到抑制，从而大大降低了到达肠道中的活菌数量。因此寻找促进鼠李糖乳杆菌增殖的物质，用以提高其在人体内的水平或促进体外培养液中的增殖，提高其对胃肠道不良环境的耐受性成为关键问题。

越来越多研究发现，中药多糖类成分尤其是补益类中药对益生菌生长具有一定促进作用［3］。黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根经提取、浓缩、纯化而成的水溶性杂多糖，是黄芪最重要的活性成分之一，具有增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等功效［4］，但能否促进鼠李糖乳杆菌的增殖并提高其抗逆性尚未见报道。本文探讨了黄芪多糖对鼠李糖乳杆菌增殖及其对酸、胆盐等胃肠道不良环境的耐受性的影响，为黄芪现代化研究及鼠李糖乳杆菌功能性食品的开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种 鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG，NBRC3425）（上海瑞楚生物科技有限公司）。1.1.2 试剂 MRS培养基（上海瑞楚生物科技有限公司）；黄芪多糖（南京泽朗医药科技有限公司）：胆盐（北京索莱宝生物科技）；胃蛋白酶（1∶10 000）、胰蛋白酶（1∶250）美国 Sigma公司。

1.1.3 主要仪器 超净工作台（上海巴艾贝斯公司）；恒温培养箱（苏州市培英实验设备有限公司）；超低温冰箱（中科美菱超低温科技股份有限公司）；高压蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备有限公司）；酸度计（上海雷磁）。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化 将-80℃冻存的鼠李糖乳杆菌接入MRS液体培养基中，37℃培养18 h，连续传代3次备用。

1.2.2 黄芪多糖复配培养基的配制 在MRS液体培养基中加入黄芪多糖，微热溶解，配制成黄芪多糖浓度分别为 0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%的APS/MRS复配增殖培养基，调整pH为7.0，121℃灭菌20 min备用。

1.2.3 不同浓度APS对LGG的增殖作用 将活化3代的菌种按1%（V/V）接种量（约1×106CFU/mL）接种于含有不同浓度黄芪多糖的MRS培养基中，平行3组，同时以不加黄芪多糖的MRS液体培养基为对照组，37℃培养16 h后，测定培养基中的活菌数。

活菌计数采用稀释平板计数法：分别取1 μL上述各组发酵液，对样品进行10倍系列梯度稀释至合适浓度，加入MRS琼脂培养基中培养48 h后计数，测定鼠李糖乳杆菌活菌含量，换算成菌落形成单位（CFU/mL）。

1.2.4 黄芪多糖对LGG产酸性能的影响 在复配质量分数2.5%黄芪多糖的条件下对活化后的LGG进行培养，在发酵过程中每隔2 h测定1次pH值，空白对照组不添加APS。

1.2.5 耐酸性实验 将于复配培养基中发酵至对数生长期的鼠李糖乳杆菌发酵液4 000 r/min离心25 min，弃去上清，沉淀菌体用灭菌MRS液体培养基调整菌悬液浓度为5.0×108CFU/mL，按体积分数3%的接种量接种于1 mL pH分别为1.5、2.0、2.5、3.0的MRS液体培养基中，37℃恒温培养2 h、4 h后取出，稀释平板计数法检测活菌数（n=3），换算成菌落形成单位（CFU/mL）并计算其存活率。存活率（%）=lgCFUN1/lgCFUN0×100%，N1=酸处理后的活菌数，N0=未处理前活菌数。

1.2.6 耐胆盐实验 在灭菌的MRS液体培养基中，无菌条件下添加0.3%的胆盐，将APS/MRS复配培养的鼠李糖乳杆菌接种于含胆盐液体MRS培养基中，37℃恒温培养3 h，检测活菌数。

1.2.7 人工模拟胃肠液稳定性实验 人工模拟胃肠液需新鲜配制［5］：在pH2.0的灭菌PBS中滤过除菌加入10 g/L的胃蛋白酶，制成人工胃液；在pH6.8的PBS中按0.3%加入胆盐，灭菌，滤过除菌加入10 g/L胰蛋白酶，制成人工肠液。

将APS/MRS复配培养到对数期的鼠李糖乳杆菌按7%（约1×109CFU/mL）接种到人工胃液，同时添加2.5%黄芪多糖，充分混匀，在37℃孵育1 h、2 h、3 h 后，取样，检测活菌数，并计算存活率。将1 mL消化3 h的含菌人工胃液离心沉淀，收集菌体，用1 mL生理盐水重悬，加入9 mL模拟肠液中，充分混匀，继续于37℃恒温培养，分别于0、1、2和 4 h取样，检测活菌数。

1.3 统计学方法

2 结果与分析

2.1 黄芪多糖对鼠李糖乳杆菌增殖的影响

相对于空白对照组，在添加黄芪多糖的发酵液中，活菌数均显著高于对照组（P＜0.05），说明黄芪多糖可以被鼠李糖乳杆菌利用。随着APS浓度的增加，鼠李糖乳杆菌的生长表现为逐渐增加的趋势，在APS添加量为2.5%时活菌数达到最大，生物量约为1×109CFU/mL。当APS高于3%时，促增殖效果反而减弱。结果见表1。

不同种类的中药多糖及同一种中药多糖的不同浓度对益生菌的增殖效果均存在一定差异［6］。黄芪多糖对鼠李糖乳杆菌的增殖作用并非浓度越高越好，高浓度APS反而会产生抑制作用。可能由于黄芪多糖作为一种功能性多糖，在合适的添加范围内对于LGG的代谢调节有着积极的促进作用；而多糖浓度的增加使发酵液渗透压增大，从而抑制了LGG的生长。

因此，一定浓度黄芪多糖对鼠李糖乳杆菌增殖具有促进作用。决定以加入浓度为2.5%的黄芪多糖来对鼠李糖乳杆菌进行增殖培养。

2.2 黄芪多糖对LGG发酵液pH的影响

在培养过程中复配黄芪多糖培养基处理的实验组和未添加黄芪多糖的对照组pH值均随着培养时间的延长而降低。因鼠李糖乳杆菌本身是一种乳酸菌，在发酵过程中产生少量醋酸和大量乳酸，因此发酵液呈酸性，发酵液pH值呈下降趋势。此外，每个时间点实验组发酵液pH值均低于对照组，表明黄芪多糖能被鼠李糖乳杆菌利用，并促进其增殖，产生酸性代谢产物，降低pH值。结果见图1。

2.3 黄芪多糖对鼠李糖乳杆菌耐酸性影响

图1 黄芪多糖对鼠李糖乳杆菌发酵液pH的影响

环境中的pH值通过影响细菌细胞膜电荷变化、改变其通透性或影响细菌酶活性而降低其代谢速率，不同微生物对酸的耐受能力不同。益生菌必须进入人体肠道才能发挥其益生功能，而从口腔经消化道进入肠道，中间必须经过胃。人体胃液呈酸性，空腹或者食用酸性食品后，pH值可低至1.5 左右［7］，因此，耐酸性是保证菌株穿过胃液安全进入肠道的一个必要条件。

在 pH 1.5 和 2.0 条件下维持2 h，以 2.5%黄芪多糖复配培养基培养的实验组鼠李糖乳杆菌活菌数分别能够达到 0.83×107CFU/mL 和 0.99×107CFU/mL，存活率分别是 55.32%和 66.17%；随着培养时间的延长，在4 h时活菌数都有不同程度的减少。而在pH值为2.5和3.0的培养基中生长较好，在 pH 3.0条件下存活率达到 94.71%，活菌数能够接近1.42×107CFU/mL。因此，鼠李糖乳杆菌对酸的耐受性随着pH升高而增加。与未添加黄芪多糖的MRS培养基培养的对照组菌株相比，在相同的酸性条件下，其存活率和活菌数均高于对照组，表明LGG经黄芪多糖处理后能增强对酸的耐受性。可能是黄芪多糖促使菌株通过酶促反应释放碱性物质以中和酸性环境，并降低其对菌株造成的损伤和代谢的抑制。结果见表2。

2.4 黄芪多糖对鼠李糖乳杆菌胆盐耐受的影响

胆盐（Bile salt）是由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐或钾盐，可在细胞外产生高渗透压，对菌体细胞造成影响。人体小肠内胆盐浓度在 0.03%～0.3%范围内波动［8］，因此本研究采用0.3%的胆盐环境，观察经黄芪多糖处理的鼠李糖乳杆菌的胆盐耐受能力，对照组菌株存活率为73.77%，APS/MRS复配培养的LGG菌株存活率为87.45%，较对照组提高了约1.2倍。表明APS能提高LGG的耐胆盐能力。结果见表3。

表1 不同浓度黄芪多糖对LGG活菌数的影响 （lgCFU/mL，n=3，±s）

表1 不同浓度黄芪多糖对LGG活菌数的影响 （lgCFU/mL，n=3，±s）

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表2 黄芪多糖对鼠李糖乳杆菌耐酸性影响

表3 黄芪多糖对胆盐胁迫下鼠李糖乳杆菌存活率的影响

当环境中的胆盐浓度高于微生物细胞质基质的浓度时，会使微生物胞内基质外渗，继而引起微生物死亡。实验中添加黄芪多糖后，在胆盐胁迫条件下，菌体的存活率高于空白对照。出现这一现象的原因可能是，黄芪多糖诱导鼠李糖乳杆菌体内生成相应的物质，增加基质浓度，使菌体内与外部环境不会存在较高浓度差；还有可能是黄芪多糖会被特异性地吸附在菌体表面，使LGG对不利于自身生长的环境产生相应的“应急机制”，继而能够避免基质外渗，增加存活率。

2.5 人工胃液耐受性实验

益生菌作为一种生物制剂，在口服后进入消化道，除了胃酸和胆汁酸盐外，还要遭受胃液中蛋白酶以及肠液中的胰蛋白酶等物质的伤害，这些因素都会明显影响其活菌数，进而影响其益生功效。为进一步考察复配黄芪多糖培养的LGG在人体胃肠道中的稳定性，本研究通过模拟人体胃肠道环境，研究了菌种在人工胃液和人工肠液中的生长和存活情况。结果见图2。

正常人胃液pH约为1～3，通常在2左右，食物通过胃的时间一般为1～3 h，实验组菌株在人工胃液中处理1 h后存活率约为73.38%，2 h后存活率仍在69.22%，各时间点均高于未经黄芪多糖处理的对照组菌株存活率。推测在胃酸和胃酶作用下，随着时间延长，黄芪多糖出现一定程度降解，产生单糖被LGG利用。此外，在人工胃液中的存活率均高于同一pH值下MRS中的存活率，这可能是胃蛋白酶对菌体具有保护作用的缘故［9］。

2.6 人工肠液中的存活数

图2 APS对LGG在人工胃液中存活率的影响

肠液中的胆盐、胰蛋白酶均不利于LGG菌株的生长。食物通过小肠的平均时间约为1.5 h，模拟肠液实验结果表明，实验组鼠李糖乳杆菌在模拟肠液中维持2 h活菌数达到1.78×108CFU/mL，4 h后活菌数仍保持在108CFU/mL以上，符合益生菌产品规定的标准。而对照组在孵育4 h后活菌数下降了1个数量级，且同一时间点实验组发酵液中的活菌数均高于未经APS处理的对照组。因此，经黄芪多糖复配培养能提高LGG菌株在胃肠环境中的稳定性。结果见表4。

表4 人工肠液中鼠李糖乳杆菌活菌数

3 讨论

近年来，由于环境污染、滥用药物和膳食结构不合理等因素，我国国民微生态营养状况正受到严重威胁。尤其滥用抗菌药物，使人体肠道微生态平衡受到严重破坏，进而引发诸多肠源性和非肠源性疾病［10］。鼠李糖乳杆菌在发酵过程中只产生L-乳酸，不会使人体产生不良反应，因此被国际公认为最安全的菌种［11］，但其制剂在制备过程中容易失活，且经口腔进入机体在胃肠道环境中会遭到破坏。国内外普遍认为活菌制剂在临床使用时至少需要达到1×106～1×107CFU/（g·mL）的活菌数［12］。因此LGG的高存活性和高稳定性始终是制剂的巨大挑战。

已有研究表明，黄芪水煎液能促进益生菌增殖［3］。作为黄芪最重要的活性成分，黄芪多糖具有改善动物胃肠道微生态平衡、抑制有害菌、扶植有益菌等作用。为促进鼠李糖乳杆菌（LGG）增殖，提高LGG制剂的稳定性和对不良环境的耐受能力，本文以黄芪多糖为促生因子，探究其对鼠李糖乳杆菌增殖的影响，初步证明了黄芪多糖能够促进鼠李糖乳杆菌增殖，提高其在胃肠道中转运时的耐受性，为开发黄芪多糖/鼠李糖乳杆菌中药微生态制剂奠定了基础。而APS对LGG促生长作用的构效关系，有待在今后的研究中进一步解析并阐明。