张冉冉，刘 杨，关 伟，陈 浩，徐慧超，李若瑜，苗宇船

（山西中医药大学，山西晋中030619）

肝脏是人体重要的代谢器官，其中肝脏非实质细胞包括 Kupffer细胞（Kupffer cells，KCs）、肝血窦内皮细胞及肝星状细胞等，且KCs在机体免疫调节及炎症反应等方面发挥着重要作用［1］。因此，有效地原代分离出活性较强的KCs，维持细胞的基本功能和活性，较好地模拟细胞在体时的环境，可对不同动物模型进行细胞学研究以及外源性物质在体代谢和毒性评价。本实验参考国内外相关文献，利用不同细胞的密度差异，优化、改良出一种简便可行、经济有效，可以分离并培养SD大鼠KCs的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性SPF级8 w龄Sprague Dawley（SD）大鼠，体质量约（250±10）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2016-0006］。基础饲料喂养，自由进食及饮水。实验前12 h禁食，不禁水。

1.1.2 主要试剂 水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，批号2013101801）；肝素钠注射液（常生千红生化制药股份有限公司，批号：160405）；D-hanks（北京索莱宝有限公司，批号：20170206）；Hanks（北京索莱宝有限公司，批号：20170623）；胶原酶Ⅳ（北京索莱宝有限公司，批号：601H132）；RPMI Medium 1640（北京索莱宝有限公司，批号：20171030）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：20170124）；PBS缓冲液（武汉博士德生物工程有限公司，批号：11D16B30）；Percoll（北京索莱宝有限公司，批号：1208D0432）；封闭用正常山羊血清原液（北京索莱宝有限公司，批号：20171023）；4%多聚甲醛（北京博奥拓达科技有限公司，批号：170512）；兔抗CD163（北京博奥森生物技术有限公司，批号：AG07056442S）；兔抗 CD68（北京博奥森生物技术有限公司，批号：AG08109233S）；免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC（上海碧云天生物技术有限公司，批号：050417170913）。

1.1.3 主要仪器 CO2恒温培养箱（美国Thermo公司）；DMI3000B/DFC450倒置相差显微镜、DM4000B/DFC450C荧光显微镜（德国Leica公司）；5804R悬垂式冷冻离心机（德国eppendorf公司）；高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；PE导管（型号：PE-50，永发塑料商行）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞分离 10%水合氯醛腹腔注射麻醉实验大鼠，肝素钠腹腔注射抗凝。“U”字型打开腹腔，腹主动脉取血后结扎，常规制备血浆以备后续其他实验。自门静脉插入PE导管，缝合线结扎固定，缓慢灌注37℃预热的D-hanks，待肝脏肿大后，剪断下腔静脉放流，等到无血性物质流出，肝脏颜色变浅时，灌注37℃预热的0.2 mg/mLⅣ型胶原酶液，灌注过程中分别用微型血管夹夹闭下腔静脉2～3次，使其在肝脏内消化1 min。待肝脏颜色土黄，弹性变差，表面呈龟裂状时表明灌注完全。摘取肝脏并移至超净台下，PBS冲洗后于37℃预热的PBS中快速划碎肝脏，弃除结缔组织。70 μm滤网过滤后，收集细胞液与0.02 mg/mLⅣ型胶原酶液等体积混合，37 ℃消化 30 min。1000×g（4 ℃）离心5 min，收集细胞沉淀，用PBS重悬。细胞悬液 50×g（4 ℃）离心 3 min，弃肝细胞沉淀，取上清300×g（4 ℃）离心 5 min，分别收集上清和细胞沉淀，将沉淀用PBS重悬。将上清1000×g（4℃）离心7 min，沉淀用PBS重悬。将2次重悬的细胞悬液混合，取1支15 mL离心管，依次加入50%Percoll、25%Percoll、细胞悬液各 3 mL 及少许 PBS，1800×g（4℃）离心20 min。小心吸取25%Percoll、50%Percoll层及两层之间的白色细胞环，加PBS后300×g（4 ℃）离心 5 min，留上清，再 1000×g（4 ℃）离心7 min。所得沉淀用不含血清的RPMI 1640培养液混悬，以适当密度接种于4个培养皿中，其中2个用于制备细胞玻片，另外2个分别进行细胞生长的动态观察和吞噬实验，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。3 h后，用37℃的RPMI 1640培养液洗去未贴壁的非实质细胞。

1.2.2 细胞鉴定

1.2.2 .1 细胞获得量及活细胞率鉴定 将细胞混悬液与0.4%台盼蓝染液按1∶1比例充分混匀，镜下观察计算细胞总数、活细胞数及活细胞率。

1.2.2 .2 KCs的鉴定 ①荧光显微镜观察。将刚分离出来的KCs在328 nm波长的激发光下观察自发荧光现象。②免疫荧光染色。将培养24 h的KCs爬片取出，用PBS清洗，4%多聚甲醛室温固定15 min；PBS再次清洗后用10%封闭用山羊血清37℃封闭1 h；分别加入抗体（兔抗大鼠CD68多克隆抗体1∶200和兔抗大鼠CD163多克隆抗体1∶100），4℃孵育过夜；PBS 清洗后加入荧光二抗（FITC标记的山羊抗兔IgG抗体1∶800），室温避光孵育2 h；PBS清洗后，加入淬灭封片剂将爬片封于载玻片上。于荧光显微镜下观察拍照。③吞噬实验。将培养24 h后的KCs培养液换为0.5%碳素墨水RPMI 1640完全培养液，培养6 h，PBS洗2次，镜下观察细胞吞噬情况。

1.2.2 .3 镜下观察细胞形态动态 观察KCs的细胞形态。

2 结 果

2.1 细胞获得量及活细胞率鉴定

KCs的获得量为9.8×106个/鼠肝，其中活细胞率占93%以上。

2.2 细胞形态学观察

刚分离出的KCs呈小球状，折光性极强，直径约10～12 μm，悬浮于培养液中；3 h后开始贴壁；静置24 h后胞质开始伸出突起，贴壁较牢；48 h后，可见部分细胞呈多角形。

2.3 荧光显微镜观察

在328 nm波长的激发光下观察，未现自发荧光现象。

2.4 免疫荧光染色实验

特异性免疫荧光抗体CD68和CD163可结合到KCs的膜表面受体，CD68和CD163阳性细胞为绿色，提示优先贴壁的细胞主要为KCs。结果见图1。

2.5 吞噬实验

培养6 h后，PBS洗2次，镜下可观察到大多数细胞胞质内出现黑色颗粒，细胞核无明显变化。结果见图1。

3 讨论

图1 大鼠KCs免疫荧光染色及吞噬实验结果

目前文献报道Kupffer细胞的分离纯化方法较为复杂，有离心淘洗法［2］、密度梯度离心法［3-4］、流式细胞术［5］等，除本实验采用的密度梯度离心法外，其他方法对实验室设备要求较高，不具有普遍适用性。我们采用了胶原酶消化结合密度梯度离心法获得了纯度较高的原代肝Kupffer细胞。

本方法有以下几点优势：①腹主动脉取血：在不影响KCs获得量的同时，能够对同一实验动物进行相应的实验相关数据检测。②胶原酶的用量较少：以往的文献报道中胶原酶用量大，最常见的是0.5 mg/mL的Ⅳ型胶原酶液，总量在50 mg～100 mg，而本实验中使用的是0.2 mg/mL的Ⅳ型胶原酶液，整个过程中总量不超过30 mg。在细胞的获得率和活力没有降低的基础上，这种方法大大减少了胶原酶的用量，节省了实验开支。③在体灌注：文献中大多使用离体循环灌注法，但在操作过程中很容易因移动导致门静脉插管脱落或者门静脉破裂，并且灌注液因循环利用会导致其pH值变化以及酶活性的变化，影响细胞的环境及细胞活性。而本实验应用在体灌注法，避免了以上缺陷，且灌注充分，节省时间。④使用PE导管：课题组在实验中发现使用一次性输液针头穿刺门静脉，经常会出现门静脉穿透或脱落、针头与门静脉结扎口因灌注压力大液体渗出严重等现象，改进使用PE导管后基本杜绝了这些现象。

本课题组实验过程中摸索出来的心得体会：①一定要用肝素钠抗凝，以防实验中出现凝血而灌注失败。有文献采用门静脉注射法，本课题组采用腹腔注射法是考虑到肝素钠直接进入血管作用太强，避免手术中出现微血管破裂，不易止血而影响手术视野和灌注效果。②Ⅳ胶原酶灌注液一定要预热到37℃，既能保证酶的活性又能够保证细胞所处的环境温度最接近在体温度。③胶原酶的灌注消化时间应该严格控制在30 min～40 min，避免因时间过长或过短而减少KCs的获得量及降低细胞活性。④控制一定的灌注速率，前灌注液D-hanks主要用于去除肝脏中的血细胞和肝细胞间质的钙离子，以利于肝细胞分离，速率控制在15 mL/min左右；而胶原酶灌注的速率则控制在10 mL/min左右，太快会导致消化不完全，若延长时间则浪费Ⅳ型胶原酶。⑤第一次离心是为了避免悬液中Ⅳ型胶原酶进一步消化KCs从而影响其活力。⑥加Percoll分离液时，事先用胎牛血清润滑管壁，使加入后分层更明显，且减少了离心中管壁对细胞沉降的影响。

综上所述，我们经过反复实验优化，改良的方法成功有效地从大鼠肝脏中提取KC，细胞的获得量、活性及纯度都能保障后续实验的进行，经济有效、简便可行。