孙 莹,方伟佳,江连洲

(1.哈尔滨商业大学旅游与烹饪学院,黑龙江哈尔滨 150000;2.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

牛肉以它特有的风味和丰富的营养受到大众喜爱,已跃居为销量仅次于猪肉的第二大肉类产品。然而牛肉富含的蛋白质和氨基酸,在为菜肴提升风味的同时,高温处理也产生了杂环胺类有害物质,甚至诱发癌症。流行病学研究表明,癌症是国际公认的除心血管疾病后,人类的第二大死因,牛肉菜肴食品安全问题引发高度关注。Sugimurat等[1]研究发现经过高温处理的鱼制品和牛肉制品表面所含化合物有致突变性,可诱发癌症,经实验发现这成分复杂的化合物中,杂环胺类化合物起主要作用。杂环胺是富含蛋白质的食品在高温下热降解中生成的一类胺类化合物,属于多环芳烃类,依据化学结构的不同,杂环胺分为氨基咪唑氮杂芳烃类(IQ型)和氨基咔啉类(非IQ型),如图1和表1所示,两大类是一种前致突变物,要经过代谢活化才会表现出致癌、致突变性[2]。国际癌症组织将杂环胺中MeIQx、PhIP、AαC、MeAαC和Trp-P-2列为2B级可能诱发人类癌症的物质,将IQ列为2A级可能引起癌症发生的物质[3-4]。因此对牛肉菜肴中杂环胺的形成机理和抑制方法的研究,也逐渐成为热点,引起公众重视。目前的综述中大多是在阐述肉制品中杂环胺的形成机理检测方法和抑制措施,而对牛肉菜肴这类烹饪菜肴的阐述却不够完备,本文就牛肉菜肴中杂环胺的检测方法和抑制措施进行详细的阐述,再就常见检测方法加以说明,最后对杂环胺的未来研究进展加以展望。

图1 杂环胺的化学结构(A)IQ型和(B)非IQ型

表1 两类杂环胺的化学名称、简写和性质

1 牛肉菜肴中杂环胺的形成机理与影响因素

1.1 牛肉菜肴中杂环胺的形成机理

牛肉含有丰富的蛋白质与氨基酸，还有一定量的肌酸或肌酐、糖类,这些是杂环胺形成的必要前提物质[5]。牛肉菜肴在300 ℃以下烹制温度时一般会生成氨基咪唑氮杂芳烃类杂环胺[6-9]。杂环胺的形成分为两部分,如图2所示:第一部分当温度达到100 ℃时肌酸(肌酐)、氨基酸、己糖环化,脱水形成IQ型杂环胺共有的氨基咪唑结构,此部分也是IQ型杂环胺起致突变作用的结构。二是其余部分由美拉德反应生成的Strecker降解产物醛或相应席夫碱,丁间醇醛缩合将这两部分连接[10];图2为IQ型杂环胺和IQx型杂环胺形成机制,形成路径的推测在MeIQx和7,8-DiMeIQx的鉴定中得到了证实。牛肉菜肴在300 ℃以上温度时一般会生成氨基咔啉类杂环胺[11],高温时主要发生的是蛋白质和氨基酸的热解,并生成许多反应碎片,这些碎片会凝结成新的杂环结构,并且自由基反应可能生成热解诱变剂,从而生成氨基咔啉类杂环胺。非IQ型中的Norharman形成过程[12]如图3所示,色氨酸经Amadori重排后得到的五环糖形式的重排产物(ARP)经脱水反应后,环氧孤对电子会促进脱水产物形成氧鎓离子。这种离子可经历两种不同类型的反应形成β-咔啉:一种是脱水和形成共轭体系来保持自身稳定,另一种是C-C断裂后进行分子内亲核取代。这种非IQ型杂环胺可以在没有肌酸(肌酐)存在下生成,并且对其他类型的杂环胺致突变性有一定增强作用,所以针对这种广泛存在牛肉菜肴中的这一类杂环胺，还需进一步对其形成机理进行研究。

图2 IQ型杂环胺形成途径

图3 通过色氨酸的Amadori重排产物形成Norharman的反应途径

1.2 牛肉菜肴中杂环胺的影响因素

牛肉菜肴中杂环胺形成的机理由于杂环胺种类的增多而变得复杂,所以也有很多影响因素。影响牛肉菜肴中杂环胺含量的主要因素有牛肉种类、烹饪方式、热量、质量传递、pH、水活性、碳水化合物、游离氨基酸、肌酸、脂质、脂质氧化物和抗氧化剂[13]。

前体物的种类和含量的差异,会对杂环胺生成含量有影响。前体物包括蛋白质、碳水化合物、游离氨基酸、肌酸、脂质、脂质氧化物和抗氧化剂。Pan[14]等实验发现中国东北和西北牛肉同比其他地区牛肉杂环胺含量相对较高。Liao等[15]研究发现由于牛肉相对于鸡鸭等肉属于红肉,在脂肪和游离氨基酸含量不同的情况下,对同样烹饪加工方式下所得杂环胺含量也会产生影响。相同加工条件下,Szterk等[16]将牛的不同食用部位烤制,检测杂环胺含量,得出结论牛肉不同部位所含产生杂环胺前体物(蛋白质、氨基酸、核苷、葡萄糖)含量不同,烹饪后杂环胺含量也不相同,且与前体物含量相关性为0.78～0.99。Bordas[17]研究发现,将牛肉肉汁中添加肌酸和氨基酸的含量就能显著提高杂环胺的生成量。Lee[18]将不同氨基酸、单糖和肌酸加入到肉汁中,结果表明均对杂环胺含量提高有效果,且效果由强到弱分别为氨酰胺、酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、核糖、葡萄糖、肌酐、果糖。由于不同地区喂养以及喂养方式差异,牛肉本身营养差异就千差万别,而在前体物质中,影响最大的为蛋白质、肌酸、肌酐这三类,在相同烹饪加工条件下,牛肉原材料中这三类含量相对较高,则形成的杂环胺含量也相对较高。

不同的烹饪加工方式和加工条件对杂环胺形成会产生影响。张秀凤[19]等分析油煎、烘烤和碳烤三种牛排加工方式,得出结论由于油煎直接与金属表面接触而产生较多杂环胺,且2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑和[4,5-f]喹喔啉只在油煎加工方式中检出;高温烘烤使蛋白质热解产生较多杂环胺;碳烤直接与明火接触,产生的杂环胺更多。Balogh等[20]通过研究得出结论,烹饪时间越长,温度越高,杂环胺含量越多,其中以2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶对烹饪温度和时间的变化最为敏感。Dong等[21]在研究烹饪温度和烹饪时间对牛肉饼两类杂环胺含量影响得出结论,烹饪时间的延长,烹饪温度的升高,都会造成牛肉饼杂环胺含量增加。总的来说,烹饪中温度越高杂环胺含量也会随之上升,当温度从200 ℃升至300 ℃时,杂环胺的生成量可增加5倍,且烹饪时间在前5 min内杂环胺含量上升最明显,时间超过十分钟杂环胺含量变化不再明显,也就是说烹饪的时间越长,温度越高,生成的杂环胺含量也会越高,并且致突变性增强。

脂肪与水分的含量一定程度上影响着杂环胺的形成。牛肉菜肴烹制过程中,脂肪起着导热作用,脂肪含量越高,导热效果越好,生成的杂环胺含量也越高。廖国周[22]指出脂肪除了导热功能以外,也参与美拉德反应从而促进杂环胺生成。徐勇[23]研究发现,相同烹饪条件下,脂肪含量为8%的瘦牛肉相比于15%的牛肉产生杂环胺含量相对较少,但是如果脂肪含量高于15%时,生成杂环胺的含量会相对减少。Hwang等[24]认为,当过量脂肪存在可以降低化学反应的活化能,同时稀释了前体物浓度,所以超过一定含量的脂肪最终会相对减少杂环胺生成。牛肉菜肴中杂环胺产生的前体物质都是水溶性的,当烹饪温度升高时,水分蒸发,牛肉菜肴中的前体物质会随着水分转移到食物表面,与烹饪器具接触的食物表面受到高温的作用,会生成更多的杂环胺。Kikugava[25]研究发现,菜肴中水分含量与杂环胺生成量成反比,水分含量越少,杂环胺生成量越高。也就是说,相对于炸、煎、烤、炒来说,煮制牛肉产生杂环胺最少。脂肪的存在一定程度上促进杂环胺的生成,达到一定量的脂肪由于稀释前体物的作用大于导热作用而使杂环胺反应减缓;水的存在会抑制杂环胺的生成,当水分蒸发,前体物暴露在食物表面,在高温作用下就会生成大量的杂环胺。

2 牛肉菜肴中杂环胺的检测方法

2.1 牛肉菜肴中杂环胺的样品预处理

牛肉菜肴样品前处理是指对菜肴样品进行分解、提取、净化、浓缩,将原本不利于检测的形式转变为可测定形式,用于接下来的定性与定量分析。由于牛肉菜肴成分复杂且杂环胺含量相对较低,因此选择适当的样品前处理办法可提高实验结果的准确性。目前牛肉菜肴样品前处理方法用的较多的为液液萃取、固相萃取、固相微萃取[26]。大多数实验在提取第一步上通常选择液液萃取作为粗提取,溶剂分为有机溶剂和无机溶剂两大类,根据分析物性质选择溶剂类型后,若选择有机溶剂,则萃取剂选择盐酸;若选择无机溶剂,则萃取剂选择有机溶剂,也可与吸附剂萃取相结合[26]。液液萃取作为初步处理后,还可进一步对牛肉菜肴样品纯化。Gross[27]提出的固相萃取法,在牛肉菜肴预处理上得到广泛的应用。Mardones等[28]使用PRS萃取柱和C18萃取柱串联对炸牛排进行固相萃取,得到的炸牛排预处理样品为杂环胺的定性定量检测做准备。Dong[29]等采用固相层析纯化对油炸牛肉饼进行样品预处理,提高实验结果可靠性。相比于固相萃取,固相微萃取实验操作时间短,方便快捷,重现性好。Lourdes Cárdenes[30]等将四种纤维涂层对比分析得出结论,在纯化杂环胺效果上,由弱到强顺序分别为PA(85 μm)、PDMS-DVB(60 μm)、CW-DVB(65 μm)和CW-TPR(50 μm),对牛肉菜肴前处理有一定的借鉴意义。

2.2 牛肉菜肴中杂环胺的检测方法

在牛肉菜肴中,杂环胺为痕量水平,加之牛肉菜肴成分复杂,烹饪过程影响因素较多,单一的光或电分析结果往往不够准确,因此牛肉菜肴中杂环胺的检测应用较灵敏的仪器且根据需要可进行串联使用。常用的检测方法有气相色谱串联质谱法(GC-MS)、高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)、高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FD)、毛细管电泳等[31]。

2.2.1 气相色谱-质谱法 气质联用技术即将气相色谱与质谱联用的分析技术。质谱法可以对成分单一的化合物进行定性分析,但是对复杂化合物就束手无策,而气相色谱法可对复杂化合物进行有效分离,弥补质谱法的缺陷,将二者联用便可达到对复杂化合物的高效、准确定性。吕慧超[32]等使DB-WAX毛细管柱的气相色谱对三种不同模拟反应体系中烧烤的杂环胺含量检测,得出结论三种模拟体系均可产生风味物质。由于杂环胺大多为极性且不具挥发性,使用气相色谱串联质谱检测时,需要对样品做衍生化处理,而这样使得实验繁琐复杂,因此气相色谱串联质谱并未得到广泛的使用[33]。

2.2.2 高效液相色谱与质谱联用技术 相比气相色谱,高效液相色谱有更广泛的应用,由于电化学氧化性和紫外吸收性是杂环胺两大特性,因此常将高效液相色谱法与光分析和电分析联用[34]。高效液相色谱法不但可以成功地分离高极性、非挥发性和热不稳定性的化合物,并且不需要衍生化程序。Jiyeong等[35]利用高效液相色谱与质谱联用的方法研究特级初榨橄榄油对烤牛排中杂环胺形成的影响,表明2 g和4 g的特级初榨橄榄油对炸牛排杂环胺形成有抑制作用,但是超过这个量的橄榄油就会对杂环胺的形成起促进作用。Kyunghee等[36]研究低聚果糖和大蒜在炸牛肉饼中杂环胺含量的影响,使用Zorbox RX-C色谱柱的液相色谱技术与质谱联用技术,表明添加5 g或15 g的大蒜可使炸牛肉饼杂环胺含量下降14%～100%。姚瑶等[37]在研究不同种香辛料的抗氧化性对酱牛肉杂环胺含量影响时,利用高效液相色谱与紫外检测和荧光检测联用技术,将空白组、对照组、香叶组三组对荧光和紫外光的吸收峰比较,得出结论香辛料的抗氧化性可降低酱牛肉中杂环胺的产生。高效液相色谱不仅具有准确性,而且可用到的检测器也有很多,如紫外可见光谱仪荧光检测器等。液相色谱与质谱的结合就是结合了色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度和高选择性,若与高效液相色谱串联为二级质谱,分析效果更佳

3 牛肉菜肴中杂环胺的抑制作用

3.1 外源物

美拉德反应过程中产生的吡啶和吡嗪等自由基可以促进杂环胺的产生,因此可利用抗氧化剂或者含有抗氧化成分的外源物质清除自由基达到降低牛肉菜肴中杂环胺含量的作用。已有研究表明外源物主要如表2示,Ahyoung[38]研究韩国树莓和洋葱对煎牛肉饼杂环胺含量的影响,得出结论韩国树莓中黄酮类化合物,单宁和酚酸的抗氧化成分可清除自由基对杂环胺反应的发生有一定的抑制作用,洋葱的添加量在4 g时对杂环胺反应有一定的抑制作用,但当洋葱添加量超过8 g时对杂环胺的产生却有促进作用,因为过多的洋葱中的糖类会进入杂环胺反应体系,促进杂环胺含量增加。杨潇[39]研究烟熏液及五种多酚化合物对卤煮牛肉杂环胺的抑制作用,实验结果表明烟熏液及五种发多酚化合物对杂环胺均有抑制作用,且烟熏液及五种发多酚化合物含量越高,抑制效果越明显,烟熏液与麦芽酚具有相同的抗氧化能力,但由于烟熏液本身含有一定量的杂环胺,所以抑制效果受到一定影响。Lee等[40]研究初级橄榄油对6种杂环胺有抑制作用;Puangsombat等[41]发现质量分数为2%姜黄使杂环胺含量整体下降;Shin等[42]研究发现,二烯丙基硫醚、烯丙基甲基硫醚、烯丙基硫醇的存在可显著降低烹饪牛肉饼的杂环胺含量,由于含硫氨基酸有效抑制热解氨基葡萄糖体系下的非酶促褐变反应,并且美拉德反应通过在含硫氨基酸中吸收硫醇的作用来抑制自由基产生,达到降低牛肉饼杂环胺含量作用[43]。聂文等[44]研究香兰素和维生素C对卤煮牛肉中杂环胺含量的影响,得出结论香兰素和维生素C对卤煮牛肉中的杂环胺都有一定抑制作用,并且维生素C的抑制作用高于香兰素,因为维生素C清除自由基的能力高于香兰素。秦川[45]研究八种黄酮类化合物对烤牛肉中杂环胺Ph IP的抑制作用,得出结论木犀草素抑制效果最差,根皮苷抑制效果最佳,且除了木犀草素以外其他七种黄酮类化合物均对烤牛肉中杂环胺Ph IP的形成有一定抑制作用。Britt等[46]研究发现在牛肉中添加樱桃组织烹饪可降低杂环胺的产生,原因是樱桃组织的酚类物质清除美拉德反应生成的自由基。Quelhas[47]研究发现经绿茶研制的牛肉烹制后,杂环胺含量降低。Rounds[48]也有类似研究,发现经绿茶腌制的牛肉馅经烹制后三种杂环胺含量明显下降,都是由于绿茶的抗氧化性所致。在后续的研究中发现木槿、葡萄籽、石榴籽、绿茶[49-53]均对杂环胺有一定抑制作用。目前在对外源物的抑制作用的研究中,停留在香辛料、烟熏液,植物类提取物这三大类上,而这些研究还未证实自由基与杂环胺的产生直接的联系,只是从实验数据上证明添加外源抗氧化成分可以有效抑制自由基的产生并且降低杂环胺的含量,抑制原理还需进一步实验证明。

表2 不同外源物添加对牛肉菜肴中杂环胺的抑制作用

3.2 烹饪方式

牛肉菜肴烹饪中以300 ℃为界限,会生成两类不同杂环胺;烹饪的时间和热量的传递方式以及烹饪方式的选择不同,杂环胺的产生会有所不同。总体来说,杂环胺的含量会随着烹饪温度升高,烹饪时间延长而增加。Ahyoung[54]等研究烹饪时间和温度对牛肉饼中两类杂环胺含量影响,研究表明在230 ℃下煎制16 min牛肉饼,杂环胺含量会骤然上升。孟晓霞[55]等研究表明牛排中的杂环胺在油炸温度低于150 ℃或者是烹饪时间少于2 min生成量较少。吕美[56]研究烘烤、微波和煎烤这三种烹饪方式下对于牛肉饼杂环胺含量的影响,由于杂环胺是在牛肉饼表面硬壳中形成,而微波加热是从食物内部加热,表面并不会有很高的温度,因此微波方式产生杂环胺含量较少。一般而言烹饪时间越长,烹饪温度越高越易产生杂环胺,在所有烹饪方式中,长时间烧烤最容易产生杂环胺。

3.3 牛肉的脂肪含量和含水量

牛肉菜肴烹制过程中,脂肪起着导热作用,脂肪含量越高,导热效果越好,生成的杂环胺含量也越高,但当脂肪过量存在时可以降低化学反应的活化能,同时稀释了前体物浓度,所以超过一定含量的脂肪最终会相对减少杂环胺生成;杂环胺产生的前体物质都是水溶性的[57],当烹饪温度升高时,水分蒸发,牛肉菜肴中的前体物质会随着水分转移到食物表面,与烹饪器具接触的食物表面受到高温的作用,会生成更多的杂环胺。Wang[58]研究发现添加大豆蛋白到牛肉馅饼中可以减少杂环胺的形成,原因是大豆蛋白增加了牛肉馅饼的持水量,水分的存在抑制了杂环胺的生成。Person等[59]研究发现向牛肉汉堡中添加一定量的NaCl或者三聚磷酸盐,牛肉汉堡中部分杂环胺含量会下降,原因是盐类的持水能力阻碍水向牛肉表面移动的作用,从而抑制杂环胺反应的发生。Johansson等[60]研究不同的6种脂肪对牛肉汉堡杂环胺形成的影响,结果发现其中人造黄油和葵花籽油两种脂肪对杂环胺的形成有一定的抑制作用,因为多不饱和脂肪酸有一定的抗氧化能力,在美拉德反应中清除自由基,这种能力大于脂肪的导热能力,因此最终结果还是减少了杂环胺的形成。

4 展望

牛杂环胺普遍存在于牛肉菜肴中,而杂环胺的致癌性和致突变性严重威胁着人类的健康,牛肉菜肴的烹制过程中,若想完全不产生杂环胺是不现实的,但是可以最大可能的向着危害最低化发展,因此对杂环胺形成机理的探究,检测方法的精进,抑制方法的成熟的进程不会停步。

形成机理:牛肉菜肴的烹制过程复杂,发生的反应繁多,在机理研究上应考虑交互作用。由于非IQ型杂环胺在没有肌酸和肌酐的条件下依然可以进行,且反应温度为家庭烹饪温度,因此此类杂环胺更加普遍存在于牛肉菜肴中,并且要对非IQ型杂环胺形成机理进行更有深度的研究。目前的实验大多研究直接加热时杂环胺的形成机理,而忽略了间接热对流如烘、烤等烹饪方式,且烹饪方法上多侧重炸制和煎制,而在卤制和煮制这样的烹饪方法上,缺少对杂环胺形成机理的研究。

检测方法:精准的仪器价格昂贵,因此检测受到一定限制,往往产生结果不精准。利用高效液相色谱法检测时,可通过改变流动相和固定相得到几次纯化来增加杂环胺的分离选择性,分离的完全会提高检测数据的准确可靠性。未来的检测仪器还是会向着更精准的方向进行,所以在同时,由于杂环胺是微量物质,在前处理的方法上也要同步跟进。

抑制方法:目前的大多数实验,都是停留在数据表面,如利用抗氧化物的外源物质的添加来抑制自由基,而数据的下降只能说明抗氧化物对杂环胺形成有一定抑制作用,但是自由基是不是促进杂环胺形成的直接原因还是没有确切说明。在抑制方法上,杂环胺种类很多,有些抑制方法会在降低一种杂环胺的同时升高另一种杂环胺的含量,不能只做单一检测,要考虑交互影响及总体杂环胺的含量。

希望在未来,杂环胺的研究可以走向我国传统牛肉菜肴的精准化、危害最小化、利益最大化。