黄 瑜,丁 博,张德全,谭万森,周 浓,*

(1.大理大学药学与化学学院,云南大理 671000;2.重庆三峡学院生物与食品工程学院,三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室,重庆 404120)

小根蒜(AlliummacrostemonBunge.)为百合科葱属多年生草本植物[1],始载于《神农本草经》,列为中品[2],为《中国药典》(2015年版一部)收载品薤白来源之一,以鳞茎入药,具有通阳散结,行气导滞之功效[3]。现代研究表明,小根蒜中含有挥发油、甾体皂苷、含氮化合物(包括腺苷、胸苷等)、含硫化合物、多糖等化学成分[4-7],具有抗肿瘤、抗炎、延缓衰老、扩张血管、提高机体免疫力等药理作用[8-12]。

核苷类成分是细胞的重要组成部分,作为生物活性成分,其对机体的免疫系统、代谢系统、神经系统及心血管系统等有着很强的调节作用,是改善人类健康和预防疾病的重要组成成分之一[13]。小根蒜(薤白)作为传统的药食同源植物,应用多以水为溶剂进行加工,其水溶性活性成分的生物活性研究已受到一定的关注,小根蒜具有紫外吸收的水溶性成分主要是核苷类物质[14-16]。因此,小根蒜所含核苷类成分可作为小根蒜质量评价指标之一,核苷类成分已被证实是重要的生物活性成分,与小根蒜生物活性(抗肿瘤、抗氧化、增强免疫功能等)[8-12]具有一定的关联性。目前,针对小根蒜(薤白)中核苷类含量的检测报道较多[14-16],但对不同产地、不同部位小根蒜中尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸苷、2′-脱氧腺苷8种碱基和核苷的同时测定未见报道。为此,本文采用HPLC法同时测定不同产地小根蒜中8种碱基和核苷类含量,对小根蒜的质量评价标准进行补充。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小根蒜植株 2014年09月至2014年10月,自采或委托采集于重庆市万州区新乡镇等小根蒜种植基地,经重庆三峡学院生物与食品工程学院周浓教授鉴定为百合科葱属小根蒜Alliummacrostemon的干燥全株(见表1);小根蒜洗净后,35 ℃下烘箱烘干,粉碎后过50目筛。尿嘧啶对照品(批号:100469-200401)、鸟嘌呤对照品(批号:140631-201205)、尿苷对照品(批号:110887-200202)、腺嘌呤对照品(批号:886-200001)、胸苷对照品(批号:101215-201401)、腺苷对照品(批号:110879-200202) 由中国食品药品检定研究院提供;鸟苷对照品、2′-脱氧腺苷对照品 纯度>98%,南京都莱生物技术有限公司;甲醇色谱纯 德国Merck公司,水 娃哈哈牌纯净水。

表1 样品来源

LC-20A型高效液相色谱仪、PDA检测器 日本岛津集团;SB-12D型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;TDZ4-WS型多管架自动平衡离心机 湖南平凡科技有限公司;ML204型分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 分别称取尿嘧啶、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷对照品,加纯净水溶解对照品,并制成质量浓度分别为40.00、21.00、330.00、22.00、399.00、118.00、118.00、103.00 μg/mL的对照品溶液,用0.45 μm混合纤维素微孔滤膜滤过,备用。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取小根蒜样品粉末(过50目筛)0.5 g,置100 mL具塞锥形瓶中,精密加蒸馏水25 mL,混匀,25 ℃室温下超声提取60 min(超声功率600 W,工作频率40 kHz),放至室温,摇匀,倒入离心管中,离心10 min(4000 r·min-1),用0.45 μm微孔滤膜过滤,即得到供试品溶液。

1.2.3 色谱条件 色谱柱为Venusil MP C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为A相为甲醇,B相为水,梯度洗脱(0 min→10 min→15 min→20 min→30 min,1% A→5% A→15% A→20% A→30% A);检测波长:260 nm;体积流量:1.0 mL/min;进样量:10 μL;柱温:35 ℃。

1.2.4 检出限和定量限 将制备好的对照品溶液进行逐级稀释后,依次进样10 μL,当信噪比等于3时,所对应的对照品溶液的质量浓度为最低检出限;当信噪比等于10时,所对应的对照品溶液的质量浓度为最低定量限。

1.3 数据处理

采用SPSS 23.0软件对不同产地的14份小根蒜鳞茎中8种碱基和核苷的含量进行聚类分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 对照品和供试品色谱分离图

按照上述色谱条件进行分析,各成分分离度良好,混合对照品和小根蒜样品(S10)色谱图见图1。

图1 核苷混合对照品(A)及小根蒜样品(B)的HPLC图谱

2.2 标准曲线方程

线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限结果见表2。

表2 8种对照品的线性方程、线性范围、检出限及定量限

2.3 精密度

取同一混合对照品溶液10 μL,按1.2.3项下色谱条件连续进样6次,通过各对照品得到的峰面积来计算RSD(相对标准偏差),以此考察仪器的精密度。由表3可知RSD均小于2%,表明该方法精密度良好。

表3 精密度实验结果

2.4 重复性

精密称取同一小根蒜鳞茎样品6份(S10),每份0.5 g,按1.2.2项下方法平行制备供试品溶液及按1.2.3项下色谱条件进行分析,分别进样10 μL。记录各核苷峰面积并计算其RSD,由表4可知RSD均小于3%,表明此方法重复性良好。

表4 重复性实验结果

2.5 稳定性

取同一供试品溶液(S10)在室温条件下密闭放置,于0、4、8、12、16、20 h进行分别测定尿嘧啶、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷,记录各核苷峰面积并计算其RSD,由表5可知RSD均小于3%,表明供试品溶液在20 h内稳定性良好。

表5 稳定性实验结果

2.6 加样回收率实验

称取已知含量的小根蒜鳞茎粉末约0.25 g(S10),共6份,分别精密依次加入1.2.1项下各核苷对照品贮备溶液适量,按1.2.2项下方法制备供试品溶液,在1.2.3项下色谱条件下进样,计算各成分的加样回收率和RSD,在验证本方法的准确性,计算加样回收率,结果见表6。结果表明,小根蒜(S10)中8种碱基和核苷的平均回收率在97.72%～100.29%,RSD为1.44%～2.97%,符合分析要求。表明该方法的准确度较高,能应用于小根蒜中8种碱基和核苷的检测与分析。

表6 小根蒜中8种碱基和核苷的加样回收率实验(n=6)

2.7 样品含量测定

不同产地、不同部位小根蒜中8种碱基和核苷的含量结果见表7。结果表明:不同产地、不同部位小根蒜中核苷类成分较类似,均含有尿嘧啶、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷,不同产地小根蒜中8种碱基和核苷类成分的含量均存在较大的差异,但各核苷类成分无论是含量还是各成分的比例并没有明显的规律,这与潘兴娇等[17]对云南重楼中核苷类成分的研究结果相一致。以核苷总量为评价指标,重庆市大足县(S3)、江西省抚州市(S8)、湖南省怀化市(S9)、安徽省绩溪县(S11)含量较高,与刘红等[14-15]的报道结果相一致,是否与生态环境、种质资源、田间管理等有关[15-16],有待进一步深入研究。因此,进行小根蒜规模化栽培时,栽培基地的选择对小根蒜的品质形成具有重大影响,本研究结果将对小根蒜的栽培基地选择具有一定的参考意义。同时,尿苷、鸟苷、腺苷为其核苷类物质的主要成分,其含量远远高于其他核苷类物质,胸苷和2′-脱氧腺苷含量次之,尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤含量最少,这与小根蒜[13]、薤(藠头)[15]的水溶性成分的研究结果一致。

表7 不同产地、不同部位小根蒜中8种成分的含量(μg·g-1,n=3)

由表7还可知,须根、茎、叶中8种碱基和核苷平均总含量超过鳞茎,同一产地不同部位的8种碱基和核苷总量部分超过传统入药部位(食用部位),特别是茎、叶生物量较大,提示这些部位均可作为核苷提取物的制备原料。但《中国药典》(2015年版)规定薤白采收时除去须根,从核苷类成分的相对含量来看是否合理,值得进一步商榷[3]。

2.8 聚类分析

分别取14批小根蒜鳞茎的含量测定结果进行聚类分析。以表8中小根蒜鳞茎中尿嘧啶、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷及总含量为依据,通过SPSS23.0版本软件欧式距离平方(squared Euclidean distance)计算样品间的相似系数,并用离差平方和法(Ward法)进行系统聚类,结果见图2。

图2 HPLC法同时测定小根蒜鳞茎中8种碱基和核苷类成分含量的聚类分析树状图

由图2可知,当分类距离为22时,可将14批小根蒜鳞茎分为2类:第一类有11批样品,即S1、S3-S5、S8-S14,此枝干样品中8种碱基和核苷总含量均数均高于小根蒜鳞茎中的平均值;第二类有3批样品,即S2、S6、S7,此枝干样品中8种碱基和核苷成分总含量均数远低于平均值。结果见表8。

表8 不同产地小根蒜鳞茎中8种碱基和核苷类成分含量聚类分析的不同组别各组分的平均含量(μg/g)

2.9 核苷的主成分分析

应用SPSS 23.0统计分析软件对不同产地小根蒜8种碱基和核苷成分含量进行主成分分析。结果见表9，本文采取特征根大于1为提取标准,因此得到2个主成分,且两个主成分的累积贡献率为78.73%。第3个主成分特征根虽然小于1,但前3个主成分的累计贡献率可达到89.63%,因此根据主成分的选取原则,可以选取前3个主成分代替原始指标进行分析。其中,第1主成分特征根λ=4.195,方差贡献率为52.44%,贡献率最大,包含的信息量大。第2主成分λ=2.103,方差贡献率为26.29%。第3主成分λ=0.872,方差贡献率为10.90%。3个主成分载荷图见图3。

表9 不同产地小根蒜鳞茎中8种碱基和核苷综合评价

图3 不同产地小根蒜鳞茎中主成分载荷图

将SPSS 23.0软件给出的因子负荷除以主成分相对应的特征根的平方根,便得到3个主成分中每个指标所对应的系数,表达式如下:C1=0.334X尿嘧啶+0.380X鸟嘌呤+0.261X尿苷+0.425X腺嘌呤+0.193X鸟苷+0.453X胸苷+0.199X腺苷+0.461X 2′-脱氧腺苷;C2=-0.340X尿嘧啶-0.086X鸟嘌呤+0.323X尿苷-0.160X腺嘌呤+0.604X鸟苷-0.082X胸苷+0.594X腺苷-0.148X 2′-脱氧腺苷;C3=0.352X尿嘧啶-0.484X鸟嘌呤-0.669X尿苷+0.154X腺嘌呤+0.267X鸟苷+0.122X胸苷+0.289X腺苷+0.025X 2′-脱氧腺苷。第1主成分C1与8个碱基和核苷类成分都呈正相关,其中与胸苷、2′-脱氧腺苷的正相关性较强。且3个主成分中,第1主成分贡献率最大,说明胸苷、2′-脱氧腺苷2个成分在小根蒜鳞茎中核苷类的质量控制方面起着重要作用。

将小根蒜鳞茎每种核苷类测的含量进行标准化,再将标准化后的值放入到3个主成分(C1、C2、C3)方程中计算,得到样品主成分得分。然后构建综合评价函数(F):Fj=ω1C1+ω2C2+ω3C3。式中C1、C2、C3为前三个主成分得分;ω1、ω2、ω3分别为前三个主成分信息贡献率。综合得分见表9。

由表9可知,来自相同省区的不同产地小根蒜(鳞茎)中8种碱基和核苷的综合评价也有显著差异,如重庆市万州区(S1)综合评价排名第1,重庆市大足区(S3)综合评价排名第3,而重庆市忠县综合评价排名第12。进一步表明小根蒜的品质表现出一定的地域和生境依赖性。

3 结论

本实验首次建立了同时测定不同产地、不同部位小根蒜中8种碱基和核苷类成分含量的HPLC法,所建立方法能使不同样品中8个指标成分均能得到良好分离,并且利用聚类分析和主成分分析方法对各地区小根蒜中含碱基和核苷的量给出了评价,为后期的质量评价及不同产地、不同部位的样品分析提供一种可靠有效的手段。结果表明，38份不同产地、不同部位小根蒜中8种碱基和核苷类成分含量在线性范围内的线性关系良好(r>0.9995)，检出限为10.78～37.62 ng·mL-1，定量限为35.81～115.28 ng·mL-1及平均回收率为97.72%～100.29%，RSD<3%。小根蒜不同部位均可检测到8种碱基和核苷类成分，且不同产地、不同部位小根蒜中8种碱基和核苷类成分的质量分数及组成结构比存在明显的差异，部分非入药、食用部位碱基和核苷含量高于其鳞茎。采用聚类分析能将不同产地的14份小根蒜鳞茎分为2类，且主成分分析法筛选出重庆市万州区质量的综合评价最好。本实验测定结果为小根蒜的高效合理利用提供了理论依据。