丁建英,徐亚男,姜 慧,张 啸

(常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏常熟 215500)

正红菇(Russulavinosalinolbl)是一种野生食用菌,其色泽呈紫红色,味道鲜美[1],具有较高的营养价值,且有降胆固醇、治疗失血性贫血、提高机体免疫力、抗癌、抗炎、增强血管收缩等药理作用[2-3]。此外,正红菇中还含有丰富的天然色素[4-5],色泽柔和、纯正,作为天然食用色素具有很大的开发潜力和市场价值。天然色素不仅健康、安全、无毒副作用,并且含有天然动植物中的营养成分和药理成分,是作为食用色素添加剂的理想选择[6],目前对于天然色素研究主要集中在植物[7]和微生物[8-9],而对菌类色素的研究不多,关于正红菇色素的提取方法的研究未见报道。超声波辅助提取法的原理是通过超声波产生的空化效应,使溶剂较快地进入固体物质,浸出更多的有效物质[10-11],已有不少研究[12-14]将该方法用于色素的提取,超声波辅助提取操作简单,节省溶剂,不易破坏提取物的构造,缩短了提取时间,且提取率高。响应面分析法常被用于优化工艺参数及检验各参数的交互影响,在功能成份的提取中得到广泛应用[15-16]。

本文用超声波辅助法提取正红菇色素,以正红菇色素提取液吸光度为指标,通过单因素实验,考察超声提取时间、提取温度、乙醇体积分数对正红菇色素提取效果的影响,并结合响应面实验对正红菇色素的提取工艺进行优化,以期为正红菇的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

正红菇 福建长汀产;乙醇(AR) 国药集团化学试剂有限公司。

HK-20B型中药粉碎机 广州市旭朗机械设备公司;KH-300B超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;EL104电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司;RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器;DL-5-B离心机 上海圣科仪器设备有限公司;TU-1901双光束紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;LSC冷冻干燥机 德国Christ公司。

1.2 实验方法

1.2.1 正红菇色素最大吸收波长的测定 正红菇去除杂质后,60 ℃干燥至恒重,粉碎过40目筛,得正红菇粉末。称取0.5 g正红菇粉末加入25 mL50%乙醇溶液,40 ℃ 超声提取30 min,在10000 r/min离心10 min,取上清液5 mL定容至50 mL,用紫外可见分光光度计在400～800 nm范围内扫描,以确定正红菇色素的最大吸收波长。

1.2.2 正红菇色素提取工艺流程 正红菇粉末→加入乙醇溶液→超声处理→离心(10 min)→取上清液→定容→测吸光度(542 nm)。

1.2.3 单因素实验 以正红菇色素吸光度为指标进行单因素实验,提取液乙醇浓度的影响:料液比1∶50 g/mL,提取温度为40 ℃,乙醇浓度分别设置为30%、40%、50%、60%、70%;超声提取时间的影响:料液比1∶50 g/mL,提取液为50%乙醇溶液,提取温度为40 ℃,提取时间分别为10、20、30、40、50、60 min;提取温度的影响:料液比1∶50 g/mL,提取液为50%乙醇溶液,提取时间为30 min,提取温度分别为40、50、60、70、80、90 ℃;料液比的影响:提取液为50%乙醇溶液,提取温度为40 ℃,提取时间为30 min,料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 g/mL。

1.2.4 响应面优化实验 根据单因素实验结果,选择超声时间、提取温度、料液比、乙醇浓度为响应变量,以542 nm处的吸光度为响应值,利用Design-Expert 7.0软件对正红菇色素超声辅助提取工艺参数进行优化[17-19],响应面因素与水平见表1。

表1 响应面实验因素水平表

1.3 数据处理

运用Excel 2010对文中数据进行统计处理。采用Design-Expert 7.0软件进行响应面实验设计及分析。

2 结果与讨论

2.1 正红菇色素的吸收光谱

将正红菇色素提取液在400～800 nm可见光区波长范围内进行扫描,得到的吸收光谱如图1所示。由图1可知,正红菇色素在542 nm处有最大吸收峰,与李惠珍等[4]报导的正红菇色素在可见光区最大吸收波长在542 nm处吸收最强相吻合,并且产生红紫色。因此,本实验选择542 nm为正红菇色素的最大吸收波长。

图1 正红菇色素的吸收光谱

2.2 正红菇色素提取的单因素实验结果

2.2.1 乙醇浓度对正红菇色素提取效果的影响 乙醇浓度对正红菇色素提取效果的影响如图2所示。由图2可知,乙醇浓度在30%～50%之间时,正红菇色素提取液的吸光度值随着乙醇体积分数的增大而增大;当乙醇浓度大于50%时,正红菇色素提取液的吸光度值逐渐减小。这是由于随着乙醇浓度的增加,乙醇作为有机溶剂,破坏色素与基质之间形成的键的能力,使色素溶解增加,导致吸光度增加;但另一方面随着乙醇浓度增加,溶剂极性降低,又会降低水溶性色素的溶出,导致吸光度降低。溶剂的极性过高和过低时,都会降低色素的溶出,因此,适宜的乙醇浓度为50%。

图2 乙醇浓度对色素提取液吸光度的影响

2.2.2 提取时间对正红菇色素提取效果的影响 提取时间对正红菇色素提取效果的影响如图3所示。由图3可知,当提取时间小于30 min时,正红菇色素溶液吸光度随着提取时间的增加而增加;当提取时间为30 min时，正红菇色素溶液吸光度达到最大；当提取时间大于30 min时,正红菇色素吸光度随着提取时间的增加而减小。这是由于,超声的空化效应增大了分子的运动速度、增大介质的穿透力,使溶剂快速进入固体物质中,同时提取初始阶段提取溶剂与物料这间存在较大的浓度差,在此浓度差别下色素成份快速溶出,吸光度增大,但当超声提取时间超过30 min后,超声的机械效应、空化效应、热效应可能破环正红菇色素结构[20],导致吸光度下降,因此,适宜的超声提取时间为30 min。

图3 提取时间对色素提取液吸光度的影响

2.2.3 提取温度对正红菇色素提取效果的影响 提取温度对正红菇色素提取的影响如图4所示。由图4可知,提取温度为40～70 ℃时,正红菇色素提取液的吸光度逐渐增大,在70 ℃时吸光度最大,70 ℃后提取液的吸光度值不增反降,这是因为,随着提取温度的升高,色素分子间运动加速,使更多的色素分子溶解在乙醇溶剂中,使提取液吸光度值变大,但是温度过高之后,导致色素分子结构被破坏,吸光度值也随着减小。因此,适宜的超声提取温度为70 ℃。

图4 提取温度对色素提取液吸光度的影响

2.2.4 料液比对正红菇色素提取效果的影响 料液比对正红菇色素提取效果的影响如图5所示。从图5中可知,随着料液比的增大,即为1∶30～1∶80 g/mL时,正红菇色素吸光度下降,这是由于溶剂的增大,色素溶液相对稀释所至。但考虑原料成本,料液比选择1∶40 g/mL为佳。

图5 料液比对色素提取液吸光度的影响

2.3 正红菇色素提取响应面实验结果

2.3.1 模型建立与方差分析 响应面实验设计方案和结果见表2。利用Design Expert 7.0软件对表2数据进行二次多项式回归拟合,得到以下回归方程:

表2 响应面实验设计与结果

Y=2.96182+0.023167+6.651×10-3B+0.069432C+1.453×10-2D+2×10-5AB+2.5×10-4AC+2.725×10-4BD-2×10-5CD-2.51833×10-4A2-2.76833×10-4B2-5.05583×10-4C2-3.28083×10-4D2

对回归模型进行方差分析,其结果见表3。由表3可见,该回归模型具有高度显著性(p<0.0001),失拟项不显著(p>0.05),决定系数R2为0.9720,信噪比为18.751,表明该模型拟合度好,实验误差小。该模型能较准确的分析影响因素和响应值之间的关系,利用该方程模型可对正红菇色素提取的最佳工艺条件进行分析。其中,自变量的一次系数A、C、D对响应值的影响极显著(p<0.01),B对响应值的影响显著(p<0.05),二次项A2、B2、C2、D2对响应值影响极显著(p<0.01),根据F值分析,对色素提取效果影响大小的排列顺序依次为:料液比>乙醇浓度>提取温度>提取时间。

表3 回归模拟方差分析

2.3.2 各因素的交互作用 根据表3回归模拟方差分析及图6～图9各因素对正红菇色素提取液的吸光度的响应面可知,提取时间和料液比(BD)的交互作用对吸光度影响极显著(p<0.01),交互项乙醇浓度和提取时间(AB)、乙醇浓度和提取时间(AC)、提取时间和提取温度(BC)的交互作用对吸光度影响显著(p<0.05),而乙醇浓度和料液比(AD)、提取温度和料液比(CD)的交互作用对吸光度影响不显著(p>0.05)。

图6 乙醇浓度与提取时间对色素提取液吸光度影响的响应曲面

图7 乙醇浓度与提取温度对色素提取液吸光度影响的响应曲面

图8 提取时间与提取温度对色素提取液吸光度影响的响应曲面

图9 料液比与提取时间对色素提取液吸光度影响的响应曲面

2.3.3 回归模型验证 利用Design-Expert软件,对多元二次响应面回归方程求偏导,获得超声波辅助提取正红菇色素的最佳工艺条件为:乙醇体积分数54.53%、提取时间28.85 min、提取温度68.41 ℃、料液比1∶35.42 g/mL,理论吸光度值为0.406。为了便于实际操作,将色素提取的最佳工艺条件修正为:乙醇体积分数55%,提取时间为29 min,提取温度为68 ℃,料液比为1∶35 g/mL。在此条件下,经过五次平行实验,正红菇色素吸光度为0.404±0.018,与理论值0.406相接近。说明本文对正红菇色素的提取工艺的响应面法优化结果较可靠。

3 结论

本实验用超声波辅助法提取正红菇色素,正红菇色素的最大吸收波长为542 nm。采用响应面法对正红菇色素的提取工艺进行了优化,其中,各因素对色素提取效果影响大小的排列顺序依次为:料液比>乙醇浓度>提取温度>提取时间,料液比、乙醇浓度、提取温度对正红菇色素的吸光度影响极显著(p<0.01),提取时间对正红菇色素的吸光度影响显著(p<0.05)。最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数为55%,提取时间为29 min,提取温度为68 ℃,料液比为1∶35 g/mL。在最佳条件下,正红菇色素的吸光度值为0.404±0.018,与理论值0.406相近,说明该色素提取工艺条件是合理可行的。本实验用超声波辅助法提取正红菇色素,为正红菇色素的高效提取提供了理论依据。