王 艳,吴鑫颖,胡 娜,唐佳代,王晓丹,王 啸,*,邱树毅,*

(1.贵州大学,贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳 550025;2.贵州大学,酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025)

短碳链羧酸酯是构成白酒香味物质的重要成分之一,在白酒酿造过程中由微生物产生的酯化酶能使呈香前体转化为香味物质[1-2]。因此,从白酒生产中筛选高产酯化酶的微生物以及强化其产酯能力,对白酒尤其是浓香型白酒起到增香和提高酒质具有重要意义[3-5]。

酯化酶来源遍及动物、植物和微生物,但目前研究较多且工业上常用的酯化酶大多数来源于微生物,自然界能产酯化酶的微生物种类繁多,例如细菌、根霉、红曲霉、酵母、放线菌等[6-8]。而在白酒生产过程中常见的产酯化酶微生物主要有细菌、根霉、红曲霉[9-11]。红曲霉在发酵培养过程中能分泌多种生理活性物质,如酯化酶、α-淀粉酶、糖化酶、红曲色素、麦角固醇、γ-氨基丁酸等,不同菌株所产生理活性物质会存在一定差异,引起全球相关领域学者的热切关注[12-14]。本文采用的FBKL3.0018分离自贵州某浓香型酒厂中温大曲[15],其来源十分安全,通过培养基及培养条件优化实验,可有效提高该菌株在白酒生产上的应用价值。

本实验采用液态发酵培养,通过单因素实验、Plackett-Burman实验和响应面试验对FBKL3.0018产酯化酶进行研究,通过考察发酵培养基组和培养条件对产酯化酶活性的影响,对产酯化酶工艺进行优化，以期提高该菌生产酯化酶的能力,为其更好地用于白酒酿造中生产香味物质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

FBKL3.0018 分离自贵州某浓香型酒厂中温大曲;麦芽汁琼脂培养基(MEA) 分析纯,青岛海博生物技术有限公司;麦芽糖、牛肉膏、蛋白胨 分析纯,北京奥博星责任有限公司;碳源和氮源、α-乙酸萘酯、固兰B盐(Fast blue B salt) 纯度≥99%,合肥博美生物科技有限责任公司(进口分装);其他试剂 均为国产分析纯。

Thermo Fisher台式高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;SPX-250B-Z生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;723型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司制造;PHS-3CpH计 上海鸿盖仪器有限公司;HH数显恒温水浴锅 江苏金坛市中大仪器厂;ZQPL-200振荡培养箱 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司。

斜面培养基:MEA。

种子培养基(%):4%葡萄糖,1.5%蛋白胨,0.15%七水硫酸镁,pH自然,用蒸馏水配制,115 ℃湿热灭菌30 min。

基础发酵培养基(g/L):5%葡萄糖,2%蛋白胨,0.15%七水硫酸镁,pH自然,用蒸馏水配制,115 ℃湿热灭菌,30 min。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

1.2.1.1 菌种活化 将转接好的菌种斜面放置于30 ℃恒温培养箱,培养活化5～7 d。

1.2.1.2 种子培养 将活化好的菌种用接种环刮至装有玻璃珠的无菌生理盐水中,30 ℃,160 r/min,振荡1 h,经无菌脱脂棉过滤后镜检,制成1×107～1×108个/mL的孢子悬液。按体积比7%的接种量将孢子悬液接种至装有50 mL/250 mL种子培养液的三角瓶中30 ℃,160 r/min摇瓶培养18 h。

1.2.1.3 发酵培养 按体积比7%的接种量将种子培养液接种至装有50 mL/250 mL基础发酵培养基的三角瓶中,30 ℃,160 r/min摇瓶培养90 h。

1.2.2 紫色红曲霉液态发酵培养产酯化酶的优化实验设计

1.2.2.1 单因素实验设计 单因素优化的固定条件为:5%葡萄糖,2%蛋白胨,0.15%七水硫酸镁,pH自然值,发酵温度30 ℃,接种量7%(v/w),装液量50 mL/250 mL,摇床转数160 r/min,发酵时间72 h。优化因素为培养基组分氮源(牛肉膏、蛋白胨、氯化铵、硝酸钠)及最优氮源浓度(1%、1.5%、2%、2.5%、3%),碳源(葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖)及最优碳源浓度(2%、4%、6%、8%、10%、12%),无机盐(无水氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锌、七水硫酸镁、磷酸二氢钾)及最优无机盐浓度(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%),pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5),发酵温度(23、27、31、35、39 ℃),接种量(3%、5%、7%、9%、11%、13%),装液量(30、35、40、45、50、55、60、65、70 mL/250 mL),摇床转数(120、140、160、180、200 r/min),发酵时间(24、48、72、96、120、144、168 h),以发酵液中酯化酶酶活为考察指标,对发酵培养基组成及培养条件进行单因素实验,每组实验重复3次,实验结果取其均值。

1.2.2.2 Plackett-Burman实验设计 根据单因素实验结果,进一步采用Design-Expert软件中N=12的Plackett-Burman实验设计,以酯化酶活性(U/mL)为响应值,对培养基中的氮源、碳源、无机盐、初始pH、发酵温度、接种量、装液量、摇床转速、发酵时间进行筛选,每个因素设置+1和-1水平,为了避免遮掩其他因素的重要性,+1水平取-1水平的1.25倍进行实验,每组实验重复3次,实验结果取其均值。PB实验设计因素水平见表1。

表1 Plackeet-Burman因素水平表

1.2.2.3 响应面试验设计 根据Plackett-Burman实验设计结果,选取对酯化酶活性影响较显著的蔗糖、发酵温度、发酵时间三个因素为自变量,以酯化酶活性(U/mL)为响应值,采用Box-Behnken进行中心组合设计,进行三因素三水平实验,每组实验重复3次,实验结果取其平均值。BB实验设计因素水平表见表2。

表2 响应面试验因素水平表

1.2.3 酯化酶活性测定 粗酶液的制备:发酵结束后,将发酵培养基过滤,真空抽滤,4 ℃,8000 r/min,离心8 min,收集上清液,用于酶活力测定。

酶活力定义:40 ℃条件下反应10 min,每分钟产生1.0 μmolα-萘酚所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

1.2.4 数据数据 利用Design-Expert 8.06软件进行Plackett-Burman实验设计和响应面分析,Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 氮源对酯化酶活性的影响 2%的氮源对酯化酶活性的影响结果如图1A所示,牛肉膏对酯化酶活性影响最大,酯化酶活为220.65 U/mL,氯化铵对酯化酶的分泌起抑制作用。相同实验条件下,不同浓度的牛肉膏对酯化酶活性影响结果如图1B所示,当牛肉膏含量为2%时,酯化酶活性为225 U/mL。有机氮(牛肉膏)和无机氮(硝酸钠)对酯化酶的分泌影响最大,因此选择两者进行复配能更有效促进酯化酶生产,相同实验条件下,实验结果如图1C所示,2%牛肉膏+0.3%硝酸钠复配时,酯化酶活性为265.87 U/mL。

图1 氮源对FBKL3.0018产酯化酶的影响

2.1.2 碳源对酯化酶活性的影响 碳源对酯化酶活性的影响结果如图2A所示,蔗糖对酯化酶活性影响最大,酯化酶活性为279.79 U/mL。相同实验条件下,不同浓度的蔗糖对酯化酶活性影响结果如图2B所示,当蔗糖含量为6%时,酯化酶活性达到292.35 U/mL。

图2 碳源对FBKL3.0018产酯化酶的影响

2.1.3 无机盐对酯化酶活性的影响 无机盐对酯化酶活性的影响,实验结果如图3A所示,其中无水氯化钙和七水硫酸镁对酯化酶分泌起促进作用,酶产量分别为311.31、287.22 U/mL,而硫酸亚铁和硫酸锌对酯化酶的分泌起抑制作用。同时选取无水氯化钙和七水硫酸镁进行较优浓度实验,结果如图3B所示,0.15%的七水硫酸镁酯化酶活性为298.48 U/mL,0.2%的无水氯化钙酯化酶活性为322.04 U/mL。

图3 无机盐对FBKL3.0018产酯化酶的影响

2.1.4 初始pH对酯化酶活性的影响 不同初始pH对酯化酶活性影响结果如图4所示。不同起始pH对酯化酶活性影响的差异较大。当发酵液初始pH为4.5时,酯化酶活性最大,为356 U/mL。因此,本研究选择发酵液初始pH为4.5进行后续实验。

图4 不同pH对FBKL3.0018产酯化酶的影响

经上述发酵培养基单因素优化实验,得到FBKL3.0018发酵培养的最优条件为2%牛肉膏+0.3% 硝酸钠、6%蔗糖、0.15%七水硫酸镁、0.2%无水氯化钙、发酵液初始pH4.5,在此基础上进行FBKL3.0018发酵培养条件对酯化酶活性的影响实验。

随后，外交部发言人12月6日在例行记者会上强调，中方已就此事分别向加方、美方提出严正交涉，并表明严正立场，要求对方立即对拘押理由作出澄清，立即释放被拘押人员，切实保障当事人的合法、正当权益。

2.1.5 发酵温度对酯化酶活性的影响 实验结果如图5所示,FBKL3.0018在不同温度下酯化酶活性各异。酯化酶活性随温度升高先增加后降低。当发酵发酵温度为31 ℃时，酯化酶活性最大为347.66 U/mL。

图5 发酵温度对FBKL3.0018产酯化酶的影响

2.1.6 接种量对酯化酶活性的影响 不同接种量对酯化酶活性的影响结果如图6所示。酯化酶活性随接种量增加先增加后降低,当接种量为9%(v/w)时达到最大,酶活为363 U/mL。

图6 接种量对FBKL3.0018产酯化酶的影响

2.1.7 溶氧量对酯化酶活性的影响 溶氧量是指水体中氧气的溶解量,水生生物利用溶解在水中的氧气来维持生命。在微生物发酵培养过程中,培养基中溶氧量对代谢物会造成一定影响。溶氧量对酯化酶活性影响结果如图7A所示,当装液量为45 mL/250 mL时，达到最大酶活为338.05 U/mL;而摇床转速对酯化酶分泌的影响结果如图7B所示,当摇床转速为160 r/min时,酯化酶活性最大为309.05 U/mL。

图7 溶氧量对FBKL3.0018产酯化酶的影响

2.1.8 发酵时间对酯化酶活性的影响 不同发酵时间对酯化酶活性的影响结果如图8所示,发酵初期,酯化酶活性随时间呈线性增加,到96 h时达最大,酶活为368.69 U/mL。

图8 发酵时间对FBKL3.0018产酯化酶的影响

通过对FBKL3.0018发酵培养基及培养条件单因素优化实验,得到该菌产酯化酶的单因素优化结果为2%牛肉膏+0.3%硝酸钠,6%蔗糖,0.2%无水氯化钙和0.15%七水硫酸镁,初始pH4.5,发酵温度31 ℃,摇床转数160 r/min,装液量45 mL/250 mL,接种量9%,发酵时间96 h。

2.2 Plackett-Burman实验设计及结果

Plackett-Burman实验设计及结果见表3,各因素主效应分析见表4。

表3 Plackeet-Burman实验设计及结果

由表4知,在95%水平以上(p<0.05)的影响因素有:发酵温度、发酵时间、蔗糖,所以本实验选取这三个差异显著的因素进行下一阶段的响应面试验。

表4 Plackeet-Burman实验因素主效应分析

2.3 FBKL3.0018产酯化酶响应面优化结果

2.3.1 响应面优化结果及回归模型方差分析 在Plackett-Burman实验设计和主效应分析的基础上,根据Box-Behnken中心组合设计,实验设计和结果见表5,进行三因素三水平实验。

表5 Box-Behnken实验设计及结果

利用中心组合实验设计,用Design-Expert 8.06软件对实验结果进行多元回归分析,得到FBKL3.0018所产酯化酶对发酵温度(A)、发酵时间(B)、蔗糖(C)拟合回归方程为:

Y=368.20+7.75A+10.88B+20.13C-5.50AB-14.00AC+12.75BC-67.23A2-49.98B2-48.47C2。

对回归模型进行方差分析,由表6知模型p<0.001,失拟项p>0.05,回归模型极显著,失拟检验不显著,表明该模型在所研究区域内拟合性较好。模型R2=0.9915,RAdj=0.9806这两个值高且接近,表明回归模型能解释生产酯化酶的培养优化过程,所以方程拟合较好;CV/%<10,证明实验可信度强及精确度较高。综上说明该回归方程给FBKL3.0018生产酯化酶提供了一个良好的模型。

表6 回归方程的方差分析

回归方程分析表明,因素B、C、AC、A2、B2、C2对酯化酶的分泌有极显著的影响(p<0.01),因素A、BC对酯化酶的产生具有显著影响(p<0.05),因素AB对酯化酶的形成影响不显著(p>0.05)。此模型中蔗糖和发酵温度及发酵时间和蔗糖之间交互作用显著,交互作用如图10、图11所示。由F值大小得出，各因素对酯化酶分泌的影响依次是C(蔗糖)>B(发酵时间)>A(发酵温度)。

2.3.2 响应曲面和等高线图及其分析 等高线的形状为椭圆形表明因素间的交互作用显著,圆形则表示因素间交互作用不显著[17]。从图9的等高线可直观看出,发酵温度和发酵时间交互作用不显著。从三维立体图可以看出红曲霉产酯化酶存在极大点,发酵温度从27 ℃升高至31 ℃时,酯化酶产量增加,当发酵温度继续升高时,酯化酶产量下降,说明酯化酶产量的极点出现在31 ℃左右。因两者交互作用不显著,发酵时间应保持在90 h左右。

图9 发酵温度和发酵时间对FBKL3.0018产酯化酶的交互影响

从图10的等高线图可以看出,在发酵时间稳定的情况下,蔗糖和发酵温度交互作用显著,从三维立体图中可以看出,酯化酶产量在合适的蔗糖浓度和发酵温度下,具有最大值,该极大值出现在中间的蔗糖浓度6.5%左右,发酵温度31 ℃左右。

图10 发酵温度和蔗糖对FBKL3.0018产酯化酶的交互影响

从图11的等高线图可以看出,发酵温度不变的条件下,发酵时间和蔗糖交互作用显著。三维立体图可以看出,增大发酵时间和蔗糖有助于提高酯化酶产量,酯化酶产量存在极大点。该极点出现在发酵时间95 h左右,蔗糖浓度6.5%左右。

图11 发酵时间和蔗糖对FBKL3.0018产酯化酶的交互影响

2.3.3 回归模型验证实验 通过响应面优化设计,经Design-Expert软件分析,得出最优条件为30.6 ℃、发酵时间95.5 h和蔗糖浓度6.2%,预测值为368.82 U/mL。为满足实验实际情况需要,将上述条件改为:发酵温度31 ℃、发酵时间96 h和蔗糖浓度6%进行响应面所建模型的预测值验证实验,以优化后的条件三次重复实验,三次实验结果均值为355.62 U/mL,SD值为0.78 U/mL,与预测值368.82 U/mL较接近,相对误差为0.96%。表明预测值与实际值具拟合性较好,优化模型有效可靠。同时,优化后的酯化酶活性(355.62 U/mL)比优化前(133.12 U/mL)提高了2.67倍,说明本实验设计的优化方案合理,得到的培养条件能有效提高酯化酶活性。

3 结论

在单因素实验基础上,采用Plackett-Burman实验设计,利用响应面对FBKL3.0018产酯化酶的发酵培养条件进行优化,建立产酯化酶的回归模型,经验证实验证明该模型切实可行。确定FBKL3.0018产酯化酶的最佳培养条件方为:牛肉膏2%、蔗糖6%、0.2%无水氯化钙和0.15%七水硫酸镁、初始pH4.5、发酵温度31 ℃、摇床转速160 r/min、装液量45 mL/250 mL、接种量9%和发酵时间96 h。在此条件下,酯化酶活性为355.62 U/mL,比优化前提高了2.67倍。