毛 顺,李蕊婷,卢士玲

(石河子大学食品学院,新疆石河子 832003)

生物胺广泛存在于发酵食品中,适量摄入对人体有益,但摄入过量则可能导致呼吸、消化、神经和高血压等疾病。生物胺主要由微生物所含有的氨基酸脱羧酶将游离氨基酸脱羧而成[1]。多种微生物如肠杆菌、微球菌、乳酸菌、芽孢杆菌、假单胞菌都能形成生物胺。腐胺作为生物胺的一种,不仅是精胺和亚精胺的前体物质,而且会加强组胺、酪胺的毒性作用,并且可以与亚硝酸盐反应生成致癌物质亚硝胺[2],摄入过量可能造成低血压、四肢疫挛等,2016年Gardini等再次提到高浓度的腐胺可促进CT-26结肠肿瘤细胞生长,与肿瘤的发展相关[3]。

胍基丁胺脱亚胺酶(Agmatine deiminase,AGDI)途径是微生物合成腐胺的一个主要途径,其中精氨酸先脱羧基形成胍基丁胺,然后去亚氨基化成腐胺[4]。负责AGDI途径的基因束包括调节基因aguR,分解代谢基因aguB、aguD、aguA和aguC[5-6]共同形成的操纵子aguBDAC。aguR编码的AguR是一个跨膜单组分信号转导蛋白,它能感受到细胞外的胍基丁胺并启动aguBDAC的转录从而生合成腐胺[7]。

NaCl会抑制细菌的生长[8],影响微生物的新陈代谢,而且能够破坏细菌细胞膜上参与生物胺合成的酶。许多研究表明,NaCl会影响编码生物胺合成相关酶的基因表达,从而抑制生物胺的产生,如La Gioia等[9]发现NaCl会影响嗜热链球菌中编码酪氨酸脱羧酶的tdcA基因,Rossi等[10]发现NaCl影响嗜热链球菌中编码组氨酸脱羧酶的hdcA基因。熏马肠是深受新疆哈萨克族人民喜爱的发酵肉制品,它依靠特有地理环境所拥有的非人工菌种经过一个月以上的时间自然发酵成熟,期间由于诸多不可控因素导致熏马肠中存在许多杂菌,这些杂菌中不乏产胺微生物[11]。本实验使用的德氏乳杆菌是从熏马肠中分离得到的产腐胺菌,目前国内外对于NaCl对德氏乳杆菌产腐胺转录调控的影响情况及其原因鲜见报道,故本实验从分子生物学角度，研究了NaCl浓度对供试菌参与AGDI途径产腐胺的调节基因aguR和操纵子aguBDAC的影响,将反转录实时荧光定量技术与超高效液相色谱技术相结合,分析基因束中调节子和操纵子基因的转录情况与腐胺积累的关系,明确了NaCl抑制细菌产生腐胺的机理,为发酵食品的安全性提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

NaCl 纯度99.5%,天津市盛奥化学试剂有限公司;改良MRS培养基(半乳糖代替葡萄糖作为碳源) 北京奥博星生物试剂公司;胍基丁胺(纯度97%)、丹磺酰氯(纯度99%)、腐胺标准品(纯度97%) 美国Sigma公司;甲醇、乙腈 均为色谱纯，天津福晨化学试剂厂;Trizol 美国Invitrogen公司;cDNA合成试剂盒 北京全式金生物技术有限公司;Bestar® SybrGreen qPCR mastermix、ROX Reference Dye 德国DBI公司;供试菌:德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii) 菌株号为MSR5-6a,GenBank登录号为MF661779,由本实验室从熏马肠中分离保存,最后送往华大基因测序所得。

LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;EON型多功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;ND2000C型微量核酸测定仪 香港基因有限公司;5417R型高速冷冻离心机 德国艾本德公司;M×3000P型荧光定量PCR仪 美国安捷伦科技公司;H-Class型超高效液相色谱仪 美国沃特世公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备 用灭菌的接种环将在-18 ℃斜面保藏的德氏乳杆菌MSR5-6a挑取一环,在MRS固体培养基中划线,37 ℃恒温培养24 h。挑取单菌落于MRS液体培养基中,37 ℃培养后将菌悬液稀释至104～105CFU/mL,备用。

1.2.2 NaCl对供试菌生长的抑制作用 在每支试管中移入5.0 mL含有0.4%胍基丁胺[12]与0.005%的磷酸吡哆醛的MRS液体培养基,然后分别加入0～6%的NaCl,灭菌冷却后接入供试菌液。37 ℃恒温培养48 h,每4 h取一次样,采用多功能酶标仪测定菌液的OD600值,使用含相应NaCl浓度的空白培养基作对照,并用pH计测定pH。

采用平板菌落计数法测定活菌数。吸取1.0 mL待测菌液,按照1∶10稀释到适宜的梯度,加入100 μL菌悬液在含1%～6% NaCl的MRS平板上,均匀涂布,另设一组不添加NaCl的培养基作为对照。37 ℃恒温培养24～48 h,菌落总数不再显著增加时进行计数。每个处理取三个重复,结果取平均值来计算菌落数和抑菌率。以未被抑制的德氏乳杆菌活菌总数为指标,不仅可以体现不同浓度NaCl对其数目的抑制效果,而且能观察到被抑制后德氏乳杆菌的生长情况。

抑菌率(%)=(CK组菌落数-处理组菌落数)/CK组菌落数×100(其中,CK组为不含NaCl组,处理组分别为含1%～6% NaCl组)

花粉产生于花粉囊，是植物的雄性生殖细胞，功能与动物精子相似。植物花粉的传播途径大致分为虫媒与风媒，而引起广大患者过敏的罪魁祸首当属风媒花。它们往往数量极大，可以凭借风的力量扩大传播范围。在辽宁地区，主要致敏花粉有蒿属、豚草、葎草等等。

1.2.3 RT-qPCR测AGDI相关基因表达量

1.2.3.1 RNA的提取 分别取1.2.2中0、1%、2%、3% NaCl浓度下(考虑到加入4%及以上浓度的NaCl时细菌增长数量少,RNA提取困难,因此不提取)[13]生长至稳定期的菌液2.0 mL，于无酶离心管中离心得菌体,采用Trizol法[14]提取细菌总RNA。RNA提取完成后，使用微量核酸测定仪测定其浓度以及在260、280 nm的光吸收值,直至OD260/OD280的值为1.8～2.0。由1%琼脂糖凝胶电泳检测清晰可见23S rRNA、16S rRNA、5S rRNA三条条带且无基因组污染,表明RNA的完整性和纯度均符合反转录的要求,方可进行下一步。

1.2.3.2 cDNA的合成 使用cDNA合成试剂盒将提取出的细菌总RNA反转录成cDNA,其中20μL体系中，总RNA添加量为500 ng。cDNA合成完毕后置于-80 ℃冰箱贮存备用。

1.2.3.3 RT-qPCR对基因表达定量 RT-qPCR反应体系制备如下:Bestar® SybrGreen qPCR mastermix 12.5 μL,上下引物各0.5 μL,cDNA模板1 μL,补充ddH2O至终体系为25 μL,加入ROX Reference Dye使其在整个体系的终浓度为0.1×,最后用微型离心机以6000 r/min的速度离心2 min以充分混匀反应液。

反转录实时荧光定量所用引物见表1。其中aguR和aguB为目的基因,tufA和rpoA为内参基因,每组基因各做三组平行。RT-qPCR扩增程序如下:Stage 1:预变性 95 ℃ 2 min;Stage 2:PCR反应40个循环 95 ℃ 10 s,55 ℃ 34 s,72 ℃ 30 s;Stage 3:融解曲线。以3% NaCl浓度下的基因表达量为对照,使用2-ΔΔCt的计算方法[16]计算其余NaCl浓度下的aguR和aguB基因表达量。

表1 反转录实时荧光定量所用引物

1.2.4 UPLC监测菌液中腐胺含量

1.2.4.1 腐胺标准溶液的配制 准确称取腐胺标准品5 mg,加入0.4 mol/L的高氯酸定容至5 mL,分别吸取25、50、100、125、250、500 μL于5 mL棕色容量瓶中,加入0.4 mol/L的高氯酸使终体积为1 mL,作为腐胺标准溶液备用。

1.2.4.2 样品的制备 以1.2.2中0、1%、2%、3% NaCl浓度下的菌液为研究对象(考虑到加入4%及以上浓度的NaCl时细菌增长数量少,腐胺几乎不产生,因此不做研究)[13],每4 h取一次样。每次取菌液后经12000 r/min离心10 min,吸取上清液1 mL,加入等体积的0.4 mol/L高氯酸,充分混匀制成菌液样品处理液备用。

1.2.4.4 色谱条件 ACQUITY UPLC® HSS T3柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm),流动相A为水,流动相B为乙腈;流速0.4 mL/min;每次进样量5 μL;柱温30 ℃;选用波长254 nm。梯度洗脱程序见表2。

表2 洗脱程序

1.2.5 数据分析与处理 所有实验数据使用Microsoft Excel 2013建立数据库,Origin 8.5 作图,并用SPSS 23进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 NaCl对供试菌株生长的抑制作用

如图1所示,与CK组相比,不同浓度NaCl中细菌的延滞期和对数期会不同程度地延长,1%～6% NaCl六组的细菌OD600始终低于CK组,说明NaCl可有效抑制供试菌的生长,减少菌体数量,且浓度越大,抑制作用越大,但NaCl并没有改变供试菌的生长趋势,只是延缓了其稳定期的到来。

图1 NaCl对德氏乳杆菌生长的抑制作用

各组供试菌在MRS固体培养基生长48 h后,通过计算不同NaCl浓度下的抑菌率,发现增大NaCl的浓度对德氏乳杆菌抑制效果显著(p<0.05)增强(图2)。说明NaCl在细菌细胞中具有良好的渗透性,且分散效果良好,能够使细胞内的水分渗出从而有效抑制细菌生长。1% NaCl组的抑菌率为5.79%,说明此浓度的NaCl对德氏乳杆菌抑制作用较小,而6% NaCl组的抑菌率为96.71%,说明此浓度下供试菌基本无活性。通过测定微生物的生长情况,初步确定了不同浓度NaCl对德氏乳杆菌具有显著的抑制效果。

图2 NaCl对供试菌的抑菌率(IR)

2.2 不同浓度NaCl对菌株生长过程中pH的影响

由图3可知,从接入供试菌开始,CK组的pH相对于其它组的下降更为迅速,1%～6% NaCl六组的pH趋于稳定后均高于CK组,原因是NaCl抑制了德氏乳杆菌的增长,所以1%～6% NaCl六组相比于CK组培养液中所含的有机酸较少。3% NaCl组与CK、1% NaCl两组pH变化曲线的趋势不同,CK与1% NaCl两组的pH先快速下降再缓慢下降最后平缓,而3% NaCl组pH先缓慢下降再快速下降,继而趋于平缓,可能是因为3%浓度的NaCl显著(p<0.05)抑制了供试菌的增长,所以从接入供试菌开始,细菌增长缓慢,细菌数量少产酸少导致pH下降缓慢,至32 h左右细菌总数达到最高峰,所以3% NaCl组在32 h左右进入稳定期时，pH依旧下降较快。

图3 不同NaCl浓度下德氏乳杆菌生长过程中pH的变化

2.3 不同NaCl浓度下的aguR基因表达

图4中，德氏乳杆菌MSR5-6a在0、1%、2%浓度的NaCl下aguR基因的表达量分别为1.62、1.18、1.49,均不到3% NaCl组的两倍,说明不同浓度NaCl情况下aguR基因表达量差别不大,即AGDI的调节基因aguR的转录不受NaCl浓度的影响,这与Del等[13]对于乳酸乳球菌的研究结果相近。AGDI基因束第一个基因编码的AguR是一种跨膜蛋白,它作为信号转导系统的一部分可以感受到培养基中的胍基丁胺浓度从而调节操纵子aguBDAC的转录[17]。也许是因为aguR通常表达量很低,目前的研究表明它不受胍基丁胺浓度[7]、葡萄糖浓度[12]、培养基pH[18]的影响,这确保位于细胞表面的AguR可以充当胍基丁胺感应器。

2.4 AguB基因表达情况分析

图5显示,CK组的aguB基因表达量是3% NaCl组的292倍,1% NaCl组的aguB基因表达量是3% NaCl组的118.6倍,2% NaCl组的则是3% NaCl组的19.1倍,说明添加NaCl能够影响aguB的转录活性。NaCl极显著(p<0.01)减少了操纵子aguBDAC的转录,且NaCl浓度越大,影响越大。可能是由于胍基丁胺可以导致AguR的二聚化,从而通过结合羧基上的C使启动子aguB促进分解代谢基因的转录继而产生腐胺[7]。而NaCl影响了AguR对于胍基丁胺的感应和随后的二聚化,从而影响了的aguB的启动。而且AGDI途径中产生的能量也会被用来抵消NaCl引起的渗透压失衡,所以添加NaCl不利于AGDI反应的发生。

图5 不同NaCl浓度下的aguB基因表达量

有研究表明，pH会影响胍基丁胺脱亚胺酶基因的表达[19],Griswold等[20]证明胍基丁胺脱亚胺酶的基因表达量在酸性环境比在中性和碱性环境中更高。Rio等[18]发现乳酸乳球菌的AGDI基因束受pH影响,酸性pH可能有利于AguR的构造[21],使得信号转导到DNA结合域更为高效,从而激活aguB的信号后增加了操纵子aguBDAC的转录。在其它乳酸菌中也发现酸性pH有利于其它产生物胺途径的转录活性,如Linares等[22]和Perez等[23]证明，酸性pH有益于耐久肠球菌和粪肠球菌中的酪胺合成。由图3可知,CK组和1% NaCl组供试菌生长到达稳定期时pH相差不大,但图5中CK组的aguB基因表达量是1% NaCl组的两倍多,说明在不受pH的影响时,NaCl能够极显著(p<0.01)抑制德氏乳杆菌AGDI途径中aguB基因的表达。而CK组的aguB基因表达量是3% NaCl组的292倍,且由图3可知,处于稳定期时两者pH相差接近1,说明CK组和3% NaCl组aguB基因表达量的差异既有NaCl浓度的影响,又有NaCl浓度不同导致的培养液中pH不同对aguB基因表达所造成的干扰。

2.5 腐胺UPLC色谱图与标准曲线

如图6所示,腐胺出峰时间在7.45 min左右,图7中,腐胺标准曲线的回归方程为y=16850x+115452,R2=0.99957>0.999,说明标准曲线的线性关系良好,符合测样要求。

图6 腐胺标准品UPLC色谱图

图7 腐胺标准曲线

2.6 不同NaCl浓度下供试菌产腐胺量分析

如图8所示,从12 h检测到腐胺开始,CK组的腐胺积累量始终大于其它组;12～36 h之间CK与1% NaCl组的腐胺积累速率显著(p<0.05)大于2% NaCl与3% NaCl组;40 h左右,各组的腐胺积累速率开始减慢。培养液中添加了足量的胍基丁胺与磷酸吡哆醛,随着供试菌培养时间的增加,可在培养液中检测到一定量的腐胺,说明德氏乳杆菌具有较强的通过AGDI途径产腐胺的能力。增加NaCl的浓度可以有效减少生物胺的积累[24]。NaCl可以减少细菌的生长,破坏位于细菌细胞膜上的氨基酸脱羧酶，从而减少生物胺的产生[25]。图1中,随着NaCl浓度的增加,细菌增长越来越慢,图8中,随着NaCl浓度的增加,培养液中腐胺的含量变小,可见NaCl对于德氏乳杆菌增长的抑制作用减少了腐胺的产生。

图8 0、1%、2%、3% NaCl浓度下的腐胺产生量

供试菌生长代谢过程中产生的乳酸不断积累,pH连续下降,腐胺积累量也慢慢增多。研究表明，乳酸菌生长过程中产酸所造成的酸性外部环境能导致产生更多的生物胺[26-27],Griswold等[20]也证明酸性pH能够促进变形链球菌产生腐胺。AGDI途径中的胍基丁胺代谢除了产生ATP外也会产生铵离子,ATP的产生是细菌增长的主要因素,还可以促进质子的排出[6],而细胞外介质中铵离子的积累可以导致碱化。Alberto等[28]和Suárez等[29]发现铵离子导致的碱化有利于微生物的耐酸性。由此我们可以推断,德氏乳杆菌MSR5-6a在生长过程中产酸可以促进AGDI反应的发生,这可能就是一种耐酸反应,可以改善微生物在低pH环境中的适应性,这一点在短乳杆菌[29]、粪肠球菌[30]、变形链球菌[20-21]中已经得到证明。图8中CK组在刚开始的12 h内培养液中基本没有检测到腐胺,这一段时间可能微生物在增加数量的同时也在对环境产生适应性。

CK和1% NaCl组在24 h后才开始大量检测到腐胺,2% NaCl和3% NaCl组在28 h左右检测到腐胺。这一现象可能与Del等[13]研究发现的AGDI基因束的调节基因AguR和启动子PaguB只有在微生物生长到对数期和稳定期的过渡期时才会被激活有关。而后期腐胺的产生速率越来越慢是因为随着供试菌对胍基丁胺的消耗,培养液中胍基丁胺的浓度变低,胍基丁胺脱亚胺酶活性降低,从而腐胺的产生减缓[31]。随着NaCl浓度的增加,操纵子aguBDAC的转录受到抑制,所以图8中CK组比其它组最终的腐胺含量都高,也就是说减少培养液中NaCl的浓度有利于胍基丁胺脱亚胺酶基因的表达,从而增加腐胺的积累。

3 结论

本研究表明,在培养液中添加NaCl,能够显著(p<0.05)抑制德氏乳杆菌的生长,且NaCl浓度越高,抑制作用越大。NaCl对德氏乳杆菌AGDI基因束中的调节基因aguR的转录影响不大,但能抑制分解代谢基因aguBDAC中aguB基因的表达。其中,CK组的基因aguB的表达量高达3% NaCl组的292倍,随着NaCl浓度的增加,AGDI基因束中的aguB基因表达量极显著(p<0.01)减少,从而整个操纵子的转录受到抑制。即添加NaCl能够通过抑制胍基丁胺脱亚胺酶的基因表达，降低供试菌通过AGDI途径产腐胺的能力,而供试菌具有较强的通过胍基丁胺脱亚胺酶途径产腐胺的能力,所以增加培养液中NaCl的浓度能够显著(p<0.05)减少腐胺的产生。因此,在熏马肠等发酵香肠制作过程中添加适当浓度的NaCl,可有效减少后期发酵过程中腐胺的积累。