曹晶晶,曾庆梅,*,张傲娜,严王慧,郑 玥,魏国华

(1.合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥 230009;2.合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥 230009)

黄酒营养丰富,有“液体蛋糕”之称,是具有特殊风味和口感的醇水溶液。它作为传统的酒精发酵饮料,是中国最受欢迎的酒精饮料之一,年消耗量达数百万升[1]。对于自然老熟过程,人们提出了“缔合说”[2]。缔合说认为,新酒中游离的酒精分子或酒精分子团较多,对感官的刺激性较大,口感欠佳;水和乙醇都是极性分子,有很强的缔合能力,在贮存过程中,黄酒中的乙醇分子与水分子之间通过氢键发生缔合作用,使更多的乙醇分子受到束缚,游离的乙醇分子数目减少,从而降低了酒精对味觉器官的刺激作用,饮酒感到柔和、圆润、刺激性小;黄酒中水和乙醇含量约占整体的95%[3]。根据缔合说,黄酒中主要存在水-水,水-乙醇和乙醇-乙醇分子间的氢键缔合作用。研究[4]表明黄酒刺激性降低被认为是水-乙醇分子的氢键结构的变化。

新生黄酒在陶坛中贮存至少一年才能上市。传统的陈化过程耗时耗力,生产周期长,影响企业经济效益[2]。目前超高压(Ultra-High Pressure,UHP)已经被广泛应用于酒类研究中[5],高压能够为酯化、氧化等化学反应提供能量,加快老熟[6],并且不会对酒体的颜色、pH、浊度等感官性质产生有害作用。但关于超高压在黄酒氢键缔合的应用报道较少;黄酒中的有机酸种类较为丰富。适量的酸在酒中起到缓冲、调和、谐味的作用[7]。有机酸中的羟基质子极性较强,可能对黄酒的氢键缔合具有一定影响[8-9]。

在溶液化学领域,醇水溶液的氢键研究是最具吸引的课题之一。而饮料酒中的氢键研究却相对较少。乔华[2]等人基于粘度考察了酒度、贮存时间及汾酒中主要微量成分对模型白酒黏度的影响。杨星[10]等对通过核磁共振研究白酒模拟体系发现,随着贮藏时间的延长,体系中氢键缔合强度逐渐增强。目前,大多数学者仅用1H-NMR光谱中水的羟基质子峰来表征氢键缔合强度[11]。本文在同时考察水和乙醇羟基质子峰基础上,还进行了粘度测量。通过有机酸协同超高压处理新生黄酒来强化氢键缔合,以期找到一种有效的方法解决新生黄酒刺激性大的问题,以指导生产实践。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

二次超纯水;99.7%乙醇、柠檬酸、苹果酸、乳酸、乙酸、丙酮酸等均为分析纯,所有试剂 均购自合肥美丰化学仪器有限公司；新压榨未经陈酿的新生黄酒、一年陈黄酒 取自安徽省古南丰酒业有限公司。

1 L YcB630/2.5超高压设备(工作压力0～600 MPa,工作温度0～80 ℃) 兵器工业第五二研究所;DZQ-400多功能真空包装机 上海嘉歆包装机械有限公司;乌式粘度计(0.6～0.7 mm) 上海前锋橡塑玻璃制品厂生产;粘度计专用恒温水浴槽 上海平轩科学仪器有限公司;超导核磁共振(NMR)光谱仪 美国安捷仑公司;sanorious PB-10 pH计 北京赛多利斯仪器系统有限公司;气质联用仪 德国布鲁克公司。

1.2 实验方法

1.2.11H-NMR检测1H-NMR用超导核磁共振光谱仪在20 ℃、400 MHz下操作。氘代试剂是由美国CIL生产的含有0.03%(体积分数)(TMS)作为外部参比的CO(CD3)2。

1.2.2 粘度检测 通过乌式粘度计测量粘度。毛细管直径为0.6～0.7 mm。通过循环恒温水浴槽将测试温度保持在(30±0.05) ℃。

1.2.3 黄酒氢键缔合强度指标的确定 用二次超纯水将无水乙醇稀释成乙醇体积分数分别为:0.00%、5.00%、10.00%、18.00%、30.00%、40.00%、50.00%、60.00%、70.00%、80.00%、90.00%、100.00%的溶液。按1.2.1和1.2.2方法测定上述溶液的1H-NMR和粘度。结合研究结果根据黄酒酒度范围确定适用于黄酒体系的氢键缔合强度检测指标。

1.2.4 样品超高压处理 将未经陈酿的新生黄酒以及一年陈黄酒于3000 r/min下离心30 min,取上清液待用。取50 mL不同浓度的乙醇-水溶液分装于聚乙烯袋中封口,排尽袋中空气,并用封口机热封口。确定超高压的压力条件为100、200、300、400 MPa,保压时间20 min,对应样品编号为W100,20 min、W200,20 min、W300,20 min、W400,20 min;超高压处理时间为5、10、20、30 min,压力为300 MPa,对应样品编号为W300,5 min、W300,10min、W300,20 min、W300,30 min;未处理样品编号为W0;温度均为室温,循环次数为一次。超高压设备的有效体积为1 L,升压速度100 MPa/min,降压时间为5～10 s,腔内水温为常温。

1.2.5 黄酒中有机酸对乙醇水氢键缔合的影响 配制柠檬酸浓度为1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1 mol/L的18%(v/v)的乙醇水溶液,按1.2.1、1.2.2方法进行1H-NMR和粘度检测。苹果酸、乳酸、乙酸、丙酮酸对18%乙醇水溶液氢键缔合影响的考察方法同柠檬酸。

1.2.6 黄酒理化指标及风味物质检测 参照国标《GB/T 13662-2008》的方法,对黄酒中酒精度、总糖、总酸、pH、氨基酸态氮、非糖固形物进行测定。黄酒挥发性风味物质的检测沿用课题组已建立的顶空固相微萃取气相色谱-质谱法。内标物选择2-乙基丁酸,具体的样品预处理方法、顶空固定微萃取条件及色谱条件参考相关文献[12]。

1.2.7 黄酒感官评价 根据国标《GB/T 13662-2008》的感官评价方法,拟定了已验证过的黄酒感官评分标准。由经过训练的小组成员(每次8人)对黄酒样品进行色泽、香气、口味以及风格根据黄酒感官实验评分表进行感官品评,取平均分为最终得分。

1.3 数据统计与分析

所有数据均为三次实验平均值,且粘度测量误差在30 s以内。核磁数据采用Mestre Nova软件处理,实验数据采用Excel、SPSS 20.0和Origin 8.0进行分析,p<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 黄酒氢键缔合强度检测指标的确定

1H-NMR可以测量质子的相对化学位移来确定氢键缔合的类型。更重要的是,它可以反映分子间氢键缔合的细节[13]。通过1H-NMR研究在乙醇摩尔浓度范围内水和乙醇混合液的氢键缔合的情况。0%、5%、18%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%(v/v)和没有H+或OH-杂质的纯乙醇溶液1H-NMR光谱如图1所示。在整个乙醇浓度范围内的羟基质子化学位移值如表1所示。

图1 乙醇-水溶液的1H-NMR光谱

表1 随着乙醇浓度变化乙醇和水羟基质子化学位移值

由图1可见,乙醇的羟基质子峰随着乙醇浓度的增加逐渐明显;甲基和亚甲基随乙醇浓度增加峰型无明显变化;在乙醇摩尔分数χ范围内,水羟基质子峰和醇羟基质子峰独立分离,易于区分。由表1看出在纯水溶液中,只有水羟基质子峰,羟基质子化学位移δ(H-OH)为4.685。另一方面,在纯乙醇溶液中,乙醇的羟基质子化学位移δ(Et-OH)为4.994。根据黄酒国家标准[14],在黄酒的酒度范围内,1H-NMR显示易于区分的乙醇和水的羟基质子峰。

图2(a)显示,在EtOH-H2O溶液中,甲基和亚甲基的质子化学位移在很大程度上不受乙醇浓度的影响。因此,它们可作为内部参考峰。图2(b)可以看出,在0<χ(乙醇摩尔浓度)<1.00范围内,乙醇羟基质子化学位移远高于纯乙醇δ(Et-OH)=4.994(χ=1),水质子化学位移比纯水的δ(H-OH)=4.685(χ=0)小得多。据了解,氢键缔合影响醇水结构。随着质子外部环境的变化,其化学位移发生变化,原来的乙醇-乙醇和水-水结构被破坏。在不同的乙醇摩尔浓度区域微观缔合结构呈现新的状态。这个结论与Burikov[14]等人通过分析拉曼和红外光谱研究了乙醇-水体系的结论一致。

图2 乙醇水溶液的1H-NMR数据及体系粘度变化

Dixit[16]认为乙醇和水混合后的热力学变化是由于系统内分子之间氢键的不完全混合造成的。因此为了确定氢键强度,我们在不同乙醇浓度的乙醇-水溶液中读取了两个羟基质子峰。

δ(χ)为溶液中乙醇和水的羟基质子化学位移加权平均值:

δ(χ)=δe(χ)χ+δw(χ)(1-χ)

式(1)

式(1):δe(χ)和δw(χ)分别表示乙醇摩尔分数为χ时,乙醇和水的羟基质子化学位移。

假设溶液混合的理想状态是指两者在混合体系内不发生任何缔合作用,δ°(χ)为理想混合时纯水和纯乙醇的羟基质子加权平均化学位移:

δ°(χ)=δe(0)χ+δw(1)(1-χ)

式(2)

式(2):δe(0)和δw(1)分别为纯乙醇和纯水未经超高压处理的羟基质子化学位移。

为了更直观的说明乙醇-水溶液的不完全混合与理想混合之间的差别,又引入公式:

Δδ=δ°(χ)-δ(χ)

式(3)

其中Δδ越大,表明乙醇和水分子混合状态与理想混合相差越远,分子间氢键缔合越强。

图2(c)显示了δ°(χ),δ(χ)随乙醇摩尔分数增加的变化情况。当乙醇摩尔浓度χ为0.550时,Δδ值达到最大值,结果与粘度测量一致(参见图2(d))。原因可能是此时乙醇与水分子之间形成稳定的氢键结构。乙醇-水溶液中乙醇与水的摩尔比接近1∶2,导致在强氢键下形成稳定的环状三聚体缔合结构[17]。

2.2 超高压处理对乙醇-水体系中醇水缔合影响

2.2.1 超高压处理压力对乙醇-水体系中醇水缔合影响 按1.2.4的方法对样品进行超高压处理,不同压力处理20 min下乙醇-水体系的Δδ变化见表2。

表2 不同压力处理20 min对醇水体系氢键缔合影响

由表2可见,随着处理压力的增大,醇水体系的Δδ值先增大后减小,并且在300 MPa下,达到最大值。这可能是由于高压对醇水溶液提供的能量,促进乙醇水体系形成更为稳定的氢键缔合群。而随着压力增加到一定值时,过多的能量破坏溶液中原有的水分子和乙醇分子之间的缔合群,溶液中游离态乙醇分子、水分子增加,使氢键缔合向着减弱的方向移动[18]。可见压力过大反而能破坏原有的醇水氢键缔合。

2.2.2 超高压处理时间对乙醇-水体系中醇水缔合影响 按1.2.4的方法对样品进行超高压处理,300 MPa不同处理时间下乙醇-水体系的Δδ变化见表3。

由表3可见,随着处理时间的增加,醇水体系的Δδ值先增大后减小,并且在20 min处理下,达到最大值。这可能是由于随着处理时间的增加,高压物理能的积聚与压力不断增大所产生的物理能的效果相同导致,并且在20 min处理条件下,更有利于促进体系的乙醇-水分子间的氢键缔合。

表3 300 MPa不同处理时间对醇水体系氢键缔合影响

分别对压力和时间两个因素进行单因素方差分析,可得压力对醇水氢键缔合的影响更显著。综合上述数据分析可得在300 MPa、20 min处理条件下,醇水体系中的乙醇分子与水分子之间的缔合得到了较大加强,为解释超高压处理能够加速酒体的陈酿过程提供了一定的实验依据。

2.3 有机酸对醇水氢键缔合的影响

2.3.1 柠檬酸对醇水氢键缔合的影响 在乙醇水溶液中,考察了不同浓度柠檬酸对-OH质子化学位移的影响(参见图3)。在柠檬酸浓度1×10-3mol/L时可引起黄酒化学转移向低场移动(参见图3(b))。如图3(c)可见,即使添加1×10-4mol/L的柠檬酸,也可以清楚地观察到可易于区分的水和乙醇的羟基质子峰。但图3(a)中当柠檬酸浓度为1×10-1mol/L中乙醇和水的两个-OH峰合并为单峰并位于较低场(δ=5.11)。有学者提出,由于快速的质子交换,醇水间氢键缔合作用加强,乙醇和水的羟基质子峰合并为单峰。因此,图4所示合并单峰的羟基质子化学位移δ值随着柠檬酸浓度的增加而增加,即氢键缔合强度不断增强。

图3 乙醇-水溶液在不同浓度柠檬酸添加下的1H-NMR光谱

图4 -OH质子化学位移随柠檬酸浓度的变化

图5 有机酸对醇水氢键缔合的影响

图6 各种有机酸的分子键线式

Fig.6 The molecular structure of various organic acids

图7 一维核磁共振氢谱

Fig.7 The proton spectra after different treatment

注:a.原酒;b.超高压处理酒;c.苹果酸-超高压处理酒;d.柠檬酸-超高压处理酒;e.一年陈黄酒。

2.3.2 其他酸对醇水氢键缔合的影响 本文还研究了苹果酸、丙酮酸、乙酸和乳酸对模型黄酒醇水氢键缔合的影响(参见图5)。结果表明所研究的酸均会导致Δδ和粘度值随着乙醇浓度的增加而增加。酸引起了H2O和EtOH分子之间的紧密关联。酸对氢键的影响可分为两个因素:未解离的酸分子(HA)和解离的H+[19]。由图5可见,有机酸对模型黄酒氢键缔合强度影响顺序为:苹果酸,乳酸,丙酮酸,乙酸。酸对氢键缔合的影响可能与-OH,-COOH和-C=O基团的数量有关。图6可知,乳酸具有一个羧基(-COOH)和一个羟基(-OH),而苹果酸具有两个羧基,且它们碳骨架一致。通过比较1.0 mol/L苹果酸与同浓度下乳酸的Δδ值,得出基于羧基对Δδ的贡献值约为0.123。黄酒中的有机酸除了含有羟基外,还有吸电子基团—羰基,这就使得羟基上的氢(通常称羟基氢)正电性更强[7]。因此酸氢键作用力比醇更强。其不仅与乙醇水的缔合群形成分子间氢键,还可能直接参与乙醇水的缔合结构网络,形成了新的酸-醇-水缔合结构网络。

2.4 有机酸协同超高压处理对黄酒氢键缔合的影响

根据上述实验结果可以设想:令有机酸与超高压协同作用处理新生黄酒,对处理后黄酒进行氢键缔合强度检测。拟找到强化黄酒氢键缔合的工艺措施,改善陈酿周期长等缺点[20]。分别取100 mL黄酒共4组,第一组为空白对照组,第二组未加有机酸,第三组和第四组分别加入10-3mol/L的柠檬酸,苹果酸。然后第二、三、四组再进行300 MPa,20 min超高压处理。并分别对这四组黄酒和一年陈黄酒进行1H-NMR检测,见图7。由于黄酒成分复杂,所含微量成分整体效果是促进醇水间羟基质子的快速交换,使得黄酒的核磁氢谱图只存在一个合并单峰。此单峰可以较好的反映黄酒的氢键缔合强度,此结果与2.3.1研究一致。由图7可见,空白对照组新酒中合并单峰的羟基质子位移δ为4.436。超高压处理组δ为4.468。苹果酸协同超高压组和柠檬酸协同超高压组δ值分别移动到4.474和4.502,而一年陈黄酒δ为4.477。超高压处理组和有机酸协同超高压组δ均向低场移动。柠檬酸协同超高压处理新生黄酒氢键缔合强度优于一年陈黄酒。由此可以认为柠檬酸协同超高压处理新生黄酒能够增强黄酒氢键缔合,改善新酒刺激辛辣味,使口感更为圆润柔和。

2.5 有机酸协同超高压处理对黄酒主要理化性质及风味成分的影响

由表4可见,处理酒相比较于原酒,其酒精度、总酸、pH均呈现一定程度的降低。总酸降低可能是添加少量有机酸有利于酯化反应向正方向进行,且与超高压的综合作用结果使总酸降低。酒精度的变化可能是有机酸协同超高压处理加强了游离乙醇分子与水的缔合作用,使更多的游离乙醇分子受到束缚。处理后的黄酒符合国标《GB/T 13662-2008》中相关指标的规定。由表5可见,经处理后的新生黄酒,其醇类、醛类风味物质均有一定程度的降低,而挥发性酯类物质含量增加。原因可能是有机酸协同超高压条件下,促进了酯化反应向正方向移动。处理酒的醇类和醛类降低,使新酒的醇醛辛辣刺激感降低。经柠檬酸协同超高压处理的新生黄酒其醇、醛、酸、酯类风味成分的总量均接近于一年陈水平。

表4 不同条件处理对黄酒主要理化指标的影响

表5 不同条件处理对黄酒风味成分的影响

2.6 有机酸协同超高压处理对黄酒感官品评的影响

由表6可见,有机酸协同超高压处理新生黄酒,透明度增加,涩度、刺激度均一定程度的降低,口感更加柔和,酒体更加协同,且无异味产生。柠檬酸协同超高压处理新生黄酒,感官品评得分略高于一年陈黄酒,这也与氢键缔合、GC-MS分析结果相符。

3 结论

通过对0～1.0 mol/L乙醇浓度的乙醇水溶液的1H-NMR及粘度检测,确定了适用于黄酒酒度范围的醇水氢键缔合强度指标:Δδ、η。相关实验表明,Δδ和η越大,氢键缔合强度越强。超高压处理乙醇水体系,改变了体系的氢键缔合强度。300 MPa,20 min超高压处理下,乙醇水氢键缔合增强最明显,但压力过大反而会破坏体系氢键。大多数的酸能促进醇水氢键缔合强度,并且基于羧基(-COOH)对Δδ贡献值约为0.123。当柠檬酸添加量为1×10-3mol/L时,由于体系快速的质子交换,一维核磁氢谱图仅出现乙醇和水的羟基质子合并单峰,此单峰较好地反映体系的醇水氢键缔合强度。氢键缔合越强,单峰越向低场移动。柠檬酸协同超高压处理黄酒氢键缔合强度略高于一年陈黄酒,且其口感和风味均得到改善。由此认为,柠檬酸协同超高压处理,可有效促进黄酒中醇水氢键缔合,降低新酒刺激味。