刘婷婷,卢春霞

(1.新疆石河子职业技术学院,新疆石河子 832000;2.长江师范学院生命科学与技术学院,重庆 408100)

大黄为蓼科(Polygonaceae)大黄属(Rheum)多年生草本,可分为掌叶大黄(R.palmatumL)、唐古特大黄(R.palmatumMaxim.ex Balf.)和药用大黄(R.officinaleBaill),以根及根状茎入药,其性味苦、寒,具有泻下清热、凉血解毒、活血祛瘀等功效[1]。现代中药化学研究证明,大黄主要含有蒽醌衍生物、苷类化合物、鞣质类、有机酸、花青素类、多糖等化学成分,其中,蒽醌衍生物(大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等)被认为是主要的活性成分,具有抗菌抗病毒[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、保肝[5]、抗肿瘤[6]等药理作用。因此,蒽醌化合物经常作为控制中药大黄的质量标准之一[7]。

目前,对大黄蒽醌的提取多采用传统的有机溶剂萃取及碱溶液沉淀等[8-9],这种传统的技术费时、费力,需要损耗大量挥发性有机溶剂。离子液体(Ionic Liquids,ILs)由于具有独特的理化性能和良好的溶解能力,近些年在天然产物提取中的应用逐渐增多[10-12]。然而,由于ILs低的蒸气压,如何除去提取物中ILs残留仍然是急待解决的问题。

大孔吸附树脂可通过静电引力(表面范德华力)、氢键相互作用等从极性溶剂和非极性溶剂中吸附目标物质[13]。由于具有吸附性强、成本低、容易再生、耗溶剂少等优点,经常被用于天然产物的分离和纯化[14-15]。徐晶等[16]采用X-5型大孔树脂富集纯化大黄提取物中5种蒽醌,5种蒽醌的含量由1.16%提高到2.66%。叶殷殷等[17]比较6种大孔树脂对大黄5种蒽醌的吸附性能,其中DM130型树脂分离能力最强,吸附量达到18.78 mg/g,解吸附率为95.38%。李倩[18]利用离子液体[bmim]Br的水溶液提取葛根总黄酮,然后利用大孔树脂分离纯化葛根素,使其含量提高了8.93%,并实现了目标物与离子液体提取溶剂的有效分离。因此,本研究拟采用离子液体溶液提取大黄蒽醌,大孔树脂分离纯化5种蒽醌化合物(大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚),同时除去提取物中残留的离子液体,为蒽醌类化合物的分离纯化及离子液体残留的去除提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大黄 本地中草药店;芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚(纯度>99%) 上海同田生物技术有限公司;离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([bmim]Br)(纯度>99%) 中科院兰州物理化学研究所绿色化学与催化中心;HPD-100、XDA-6、AB-8、LX-38、ADS-7、ADS-17型号大孔树脂 沧州宝恩化工有限公司和南开大学化工厂和西安蓝晓科技有限公司;甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯,实验用水为超纯水。

CW-2000超声-微波协同萃取仪 上海新拓分析仪器科技有限公司;SHZ-82A 水浴恒温振荡器 金坛市医疗仪器厂;BSA224S-CW天平 德国 Sartorius 公司;TU-1901紫外分光光度仪 北京普析通用仪器有限公司;超高效液相色谱-串联质谱 美国Waters公司;MS3 basic涡旋混合器 德国IKA公司;R-210旋转蒸发器 瑞士步琦公司;KQ-500DB超声波清洗器 昆山市超声仪器公司;优普超纯水制造系统 成都超纯科技有限公司;ZK-82B真空干燥箱 上海市实验仪器厂;φ2.0 cm×50 cm玻璃层析柱 上海厦美生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液配制 称取大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚对照品各5.0、12.5、30、5.5、13.4 mg,用甲醇定容至50 mL,4 ℃避光保存。

1.2.2 蒽醌及离子液体的测定条件 5种蒽醌化合物及离子液体[bmim]Br的测定条件参考Lu报道的方法[12,19]。

色谱条件:色谱柱(Acquity UPLCTM BEH C18柱,100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温:40 ℃;流动相:(A)乙腈,(B)0.1%的甲酸溶液,梯度洗脱11 min内流动相由30A/70B变为100A/0B;流速:0.3 mL/min;检测器:DAD;检测波长:280 nm,扫描范围:200～600 nm;进样量:0.5 μL。

质谱条件:离子源:电喷雾电离(ESI-),毛细管电压:3.0 kV,锥孔电压:24 V,离子源温度:100 ℃,脱溶剂气温度:400 ℃,碰撞能量:6 eV,反溶剂气流:500 L/h,质量范围:100～1000 m/z。

1.2.3 大黄提取液的制备 参考文献[12]对大黄中蒽醌化合物进行提取。大黄样品50 ℃条件下干燥10 h,中药粉碎机进行粉碎,过60目筛,准确称量大黄粉末11.6 g,置于圆底烧瓶中,添加2.0 mol/L的[bmim]Br提取溶液,料液比为1∶15 (g/mL),采用超声微波协同提取法提取蒽醌类化合物,微波功率为500 W,提取时间为2 min。重复提取2次,合并提取液,抽滤除去滤渣,收集上清液,浓缩、定容至200 mL,UPLC-MS/MS测定5种蒽醌的含量。提取液中5种游离蒽醌总浓度为 4.16 mg/mL,避光、4 ℃保存,供大孔树脂分离纯化时使用。

1.2.4 大孔树脂的预处理 大孔树脂首先用95%的乙醇浸泡24 h,然后将树脂装入层析柱,用95%的乙醇淋洗,至流出的液体不再浑浊为止,再用蒸馏水洗净至无乙醇。

1.2.5 静态吸附与解吸实验 分别取预处理过的不同型号(HPD-100、XDA-6、AB-8、LX-38、ADS-7和ADS-17)的树脂各5 g,置于锥形瓶中,加入大黄提取溶液20 mL,于120 r/min的摇床中进行静态吸附10 h,取上清液,测定5种蒽醌含量。树脂倾出吸附液后,先用蒸馏水冲洗,然后用95%的乙醇在摇床中解吸10 h,测定其解吸液中的蒽醌浓度,每个实验重复操作3次。按以下公式计算各种树脂的吸附量、吸附率和解吸率:

式(1)

式(2)

式(3)

式(1)中:Qe为平衡吸附量(mg/g),C0为原液中5种蒽醌总浓度(mg/mL),Ce为吸附平衡后溶液中5种蒽醌总浓度(mg/mL),Vi为溶液的体积(mL),W为树脂重量(g);式(2)中:E为吸附率(%),其他同式(1);式(3)中:D为解吸率(%),Cd为解吸液浓度(mg/mL),Vd为解吸液体积(mL),其他同式(1)。

1.2.6 静态吸附等温线的绘制 将提取溶液稀释,使5种蒽醌总浓度分别为0.52、1.56、2.60、3.12、3.64、4.16 mg/mL,称取预处理过的HPD-100树脂5.0 g,分别加入上述稀释的溶液中,在不同温度下(25、30、35 ℃),置于120 r/min的水浴恒温振荡器中,静态吸附10 h,之后分别测定上清液中5种蒽醌含量(Ce),计算吸附量(Qe),以平衡吸附量对平衡浓度作图得静态吸附等温线。每个实验重复操作3次。

1.2.7 吸附动力学实验 准确称取HPD-100大孔树脂5.0 g,分别置于50 mL具塞锥形瓶中,加入20 mL提取液(5种蒽醌总含量3.64 mg/mL),于25 ℃恒温水浴振荡器中振摇吸附,分别间隔10、20、40、80、120、160、200 min取上清液,UPLC-MS/MS法测定5种蒽醌含量。每个实验重复操作3次。

1.2.8 动态吸附和解吸条件的确定 取50 mL(26.3 g)预处理过的HPD-100大孔树脂湿法装柱。吸取一定体积的提取液(5种蒽醌总含量为3.64 mg/mL)上柱,以一定的流速过层析柱,动态吸附平衡后,用蒸馏水淋洗,用一定浓度的乙醇溶液解吸目标物。实验中采用UPLC-MS/MS测定流出液和洗脱液中5种蒽醌含量。分别对径高比(1∶5、1∶8、1∶12)、上样流速(1.0、1.5、2.0 BV/h)、上样体积(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0BV)、洗脱液浓度(乙醇溶液75%、85%、95%)和洗脱体积(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 BV)等动态吸附和解吸条件进行优化,确定最佳条件。每个实验重复操作3次。

1.2.9 优化工艺条件的验证 在优化条件下对大黄蒽醌进行吸附和解吸,并计算其吸附率、解吸率,提取物中5种蒽醌含量、纯化后5种蒽醌含量和总回收率。同时,利用UPLC-MS/MS技术来检测提取物中的离子液体是否去除。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的选择

不同型号大孔树脂对大黄5种蒽醌的静态吸附结果见表1。由表1可知,HPD-100、XDA-6和AB-8树脂对5种蒽醌的吸附性能优于其余三种极性树脂,其中HPD-100树脂对5种蒽醌的吸附能力最强,吸附率为81.1%,解析率为83.8%。HPD-100树脂表现出较高的吸附特性可能与其较大比表面积有关,并和溶质有着相似的极性有关。因此,选择非极性树脂HPD-100用于大黄5种蒽醌的纯化。

表1 不同型号大孔树脂对大黄5种蒽醌的吸附性能比较

2.2 静态吸附等温线

HPD-100大孔树脂对5种蒽醌的吸附等温线见图1。如图1所示,随着温度的升高,5种蒽醌在树脂上的总吸附量均减少,在25 ℃时吸附量达到最大,说明吸附行为为放热过程。同时,5种蒽醌在树脂上的总吸附量随着浓度的升高而升高,当5种蒽醌总浓度达到3.64 mg/mL时,吸附量增加趋势变缓,即趋于饱和,最大结合量为13.5 mg/g。因此,后续实验选择上样总浓度(5种蒽醌)为3.64 mg/mL,吸附温度25 ℃。

图1 不同温度下5种蒽醌化合物在HPD-100树脂上的静态吸附等温线

2.3 吸附动力学

图2为HPD-100大孔树脂对大黄5种蒽醌的吸附动力学曲线,5种蒽醌在HPD-100树脂上的总含量随时间增加而增加,在60 min以前,吸附量呈持续上升趋势,约在60 min时达到吸附平衡,随后吸附量随着时间的延长无明显变化。

图2 HPD-100树脂对蒽醌化合物吸附动力学曲线

2.4 动态吸附和解吸条件优化

2.4.1 径高比对吸附能力的影响 高的径高比使得被吸附溶质和柱床有长的接触时间,有利于吸附;相反径高比越低,意味着质量转移速率越低,溶质和吸附剂接触时间短,也就容易发生泄露。本实验研究了不同径高比对大黄5种蒽醌的吸附效果,采用85%的乙醇作为洗脱溶剂,结果见图3。由图3可知,随着径高比的增加,5种蒽醌的总吸附量明显增加;当径高比为1∶8时,这种增加趋势明显变缓,表明吸附接近饱和。由于大的径高比会导致柱压上升,因此,层析柱径高比选择1∶8。

图3 径高比对5种蒽醌吸附能力的影响

2.4.2 上样体积和流速对吸附能力的影响 溶质分子在树脂上的吸附是一个平衡过程,流速越慢,溶质有充裕的时间扩散到吸附剂的活性位点上;反之则容易发生泄露,从而降低柱的动态吸附量。不同流速的上样溶液的动态吸附曲线见图4。由图4可知,随着上样流速的增加,蒽醌动态吸附的泄露点均逐渐提前,在1.0 BV/h的流速下,蒽醌在2.5 BV时开始泄露。因此,选择上样溶液体积为2.0 BV,流速为1.0 BV/h。

图4 蒽醌在不同加样流速下的动态吸附曲线

2.4.3 洗脱液的选择 洗脱液对解吸率有着一定的影响,本实验基于蒽醌溶解性及产品安全性考虑,选用经济、低毒的乙醇溶液作为洗脱溶剂。不同体积分数的乙醇溶液的洗脱效果见图5。由图5可知,5种蒽醌的总解吸率随着乙醇体积分数增加而增加,但差异不明显,综合考虑解吸率和经济效益,选择85%的乙醇溶液作为洗脱溶剂。

图5 乙醇浓度对5种蒽醌化合物解吸能力的影响

2.4.4 洗脱曲线的考察 为了获得高的解吸率和消耗尽量少的溶剂,实验在上述优化条件下采用不同体积的乙醇溶液(85%)洗脱层析柱,测定洗脱液中5种蒽醌的含量,绘制洗脱曲线(图6)。由图6中可知,乙醇用量为3.0 BV时,5种蒽醌化合物基本洗脱完全。故选择的乙醇洗脱体积为3.0 BV。

图6 5种蒽醌在HPD-100树脂上的洗脱曲线

2.5 工艺条件验证

采用上述最佳优化条件对5种蒽醌化合物进行分离纯化,结果见表2。由表2可知,在初步富集后,5种蒽醌的总含量从粗提物的7.13%增加为20.5%,总回收率为98.7%。五种蒽醌化合物经HPD-100树脂纯化前后的色谱图见图7。由色谱图可知,蒽醌粗提物经一次分离纯化后,一些杂质峰面积明显变小,5种蒽醌化合物得到了有效富集,提取物中残留的离子液体[bmim]Br被去除。

表2 最佳条件下5种蒽醌在HPD-100树脂上的纯化结果(n=3)

图7 大黄提取物分离纯化前后的色谱图

3 结论

本实验研究了6种大孔吸附树脂(HPD-100、XDA-6、AB-8、LX-38、ADS-7和ADS-17)对大黄5种蒽醌(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)的吸附-解吸效果,对最优大孔树脂下的动态吸附特性进行了初步研究。结果表明,HPD-100 树脂吸附和解吸率最为理想;筛选得到大黄5种蒽醌分离纯化的优化条件为:层析柱径高比为1∶8,上样溶液5种蒽醌总含量为 3.64 mg/mL,上样流速 1.0 BV/h,上样体积为2.0 BV,85%的乙醇为洗脱溶液,洗脱流速 1.0 BV/h,洗脱体积为3.0 BV。经该工艺纯化后,5种蒽醌总含量由原来粗提物中的7.13%提高到20.5%,是原来的2.88倍。同时,提取物中残留的[bmim]Br被除去,表明本实验选择的优化条件具有可行性。