李明智,童 微,胡婕伦,殷军艺,聂少平,黄晓君

(南昌大学,食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是我国名贵中草药[1],系兰科石斛属植物[2],具有很高的药用价值[3]。铁皮石斛为《中华人民共和国药典》2005年版收载的正品石斛之一[4],具有益胃生津、滋阴清热功效,可用于阴伤津亏,口干烦躁,食少干呕,病后虚热以及目暗不明等[5-6]。由于中药铁皮石斛功效确切,2015年版《中国药典》将其作为新增品种单独列出,与中药石斛进行区分[3]。铁皮石斛化学成分多样,主要有生物碱、多糖、菲类、联苄类、香豆素类、花青素等化合物[7-9]。其中,多糖在铁皮石斛中的含量较高(含量大于25%)[10-13],且具有抗肿瘤[14-15]、增强免疫力[16-20]、降血糖[21]等多种功效。近年来,石斛多糖的研究逐渐引起人们的重视,其中免疫调节活性备受关注[16,19-20],且多糖的生物活性与其相对分子质量的大小有关[22-25]。国内外对铁皮石斛多糖及修饰后的铁皮石斛多糖能够增强淋巴细胞免疫及体液免疫的报道较多[18-20,26],Huang[16]等报道铁皮石斛多糖可促进脾淋巴细胞的增殖和分化,提高血清中免疫球蛋白含量,刺激腹腔巨噬细胞的吞噬功能。童微[10]等报道硫酸化和脱乙酰化修饰衍生物能够增强铁皮石斛多糖对RAW 264.7巨噬细胞的免疫活性,而羧甲基化修饰则表现为显著的抑制作用。目前对于铁皮石斛多糖不同分级组分与其体外免疫活性关系的报道还缺乏全面性[10,18,27-29],但Cai[26]等报道铁皮石斛水提物、粗多糖及纯多糖均可增强RAW 264.7巨噬细胞的吞噬活性及NO、细胞因子的分泌并增强其相关mRNA及蛋白的表达,Xia[20]等报道其分离的两个组分533.7 kDa DOP-1和159.5 kDa DOP-2在体内均能显著增强脾淋巴细胞增殖及其细胞因子分泌,提升NK细胞毒性,增强巨噬细胞吞噬活性及其细胞因子的分泌。因此本实验通过考察不同分子量的铁皮石斛多糖分级组分与其体外免疫活性的关系,以期完善铁皮石斛多糖不同分级组分与其体外免疫活性存在的关系,为铁皮石斛多糖在天然保健产品领域的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

铁皮石斛干茎 由云南金九地生物科技有限公司提供;小鼠巨噬细胞株RAW264.7 购自于中国科学院上海生科院细胞资源中心;脂多糖(LPS)、透析袋(截留分子量3500 Da)、岩藻糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸标准品 美国Sigma公司;CCK-8试剂盒(CCK8) 日本同仁公司;NO检测试剂盒 南京建成生物有限公司;TNF-α、IL-1β试剂盒 武汉博士德公司;耐高温α-淀粉酶(40000 U/g) 杰能科(中国)生物工程有限公司;咔唑 上海国药集团;牛血清白蛋白标品 美国 AMRESCO 公司;考马斯亮兰G-250 Bio-Rad公司;氯磺酸、一氯乙酸 萨恩化学技术(上海)有限公司;浓硫酸、无水碳酸钠、浓盐酸、氢氧化钠、吡啶、苯酚、正己烷、95%乙醇、NaN3、苯酚、甲醇、甲酰胺、无水乙醇等 均为国产分析纯。

Agilent 1260 HPLC系统 美国Agilent Technologys公司;TU-1900双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用有限责任公司;Dionex ICS-5000离子交换色谱系统 美国Dionex公司;HPSEC-MALLS色谱系统 美国Wyatt Technology公司;高效分子排阻色谱系统 美国Brookhaven公司;TGL-16GA CO2培养箱、Varioskan Flash全波长多功能酶标仪 美国Thermo公司;HGC-24A医用超净工作台 吴江市净化设备总厂。

1.2 实验方法

1.2.1 铁皮石斛纯多糖的制备 根据本实验室的前期研究成果[12],现将纯多糖制备流程简化如下:铁皮石斛干茎→粉碎机粉碎,过60目筛→正己烷、95%乙醇溶液分别浸泡24 h→滤渣→70 ℃热水浸提4 h→10000×g离心20 min→上清液真空浓缩至原有体积的1/6→80%乙醇醇沉过夜→10000×g离心20 min→沉淀去离子水复溶→冷冻干燥→铁皮石斛粗多糖(DOC)→溶解→70 ℃α-淀粉酶酶解2 h→-80 ℃冻融4次→12000×g离心40 min→3500 Da透析袋透析72 h→80%乙醇醇沉过夜→10000×g离心20 min→去离子水复溶→冷冻干燥→铁皮石斛纯多糖(DOP)。

1.2.2 铁皮石斛纯多糖分级组分的制备及分析

1.2.2.1 铁皮石斛纯多糖的分级 10 g DOP溶解于1 L的去离子水中形成浓度为1%(w/v,g/mL)的多糖溶液,然后向溶液中缓慢滴加无水乙醇,并不断搅拌使溶液中乙醇浓度为30%(v/v,mL/mL),静置过夜,离心20 min(4 ℃、10000×g),沉淀复溶冻干得F30组分。然后向收集的上清液中缓慢滴加无水乙醇,直至混合溶液中乙醇浓度达到40%(v/v,mL/mL),静置过夜,离心20 min(4 ℃、10000×g),沉淀复溶冻干得F40组分。将得到的上清液再次进行醇沉使乙醇浓度达到50%,沉淀复溶冻干得F50组分,然后将收集得到的上清液在60 ℃下旋蒸并冻干得到F50S组分。

1.2.2.2 铁皮石斛多糖不同级分化学成分分析 以甘露糖为标准品,采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[30];以半乳糖醛酸为标准品,采用硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量[31];以牛血清白蛋白为标准品,采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[32]。

1.2.2.3 铁皮石斛多糖不同级分的单糖组成分析 分别称取5 mg多糖样品,加入0.5 mL 12 mol/L H2SO4溶液,冰水浴搅拌30 min,然后加水稀释至2 mol/L,100 ℃下油浴搅拌水解 2 h,定容至50 mL,混匀后吸取1 mL定容至10 mL。单糖标品为鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)、核糖(Rib)、葡萄糖醛酸(Glca)和半乳糖醛酸(Gala),配制成不同浓度的混标,采用相同的色谱条件测定,过0.22 μm滤膜后经Dionex ICS-5000系统检测。

检测器:脉冲安培检测器;色谱条件:CarboPac PA20G保护柱(3 mm×30 mm)和CarboPac PA20分析柱(3 mm×150 mm)串联;流动相A为0.25 mol/L NaOH溶液,流动相B为超纯水,流动相C为1 mol/L CH3COONa,淋洗液梯度洗脱条件见表1;流速为0.5 mL/min,柱温30 ℃,检测器温度为35 ℃,进样量10 μL。

表1 离子交换色谱洗脱条件

1.2.2.4 铁皮石斛纯多糖及分级组分分子量分析 采用高效液相色谱联用多角度激光光散射(HPSEC-MALLS)色谱系统分析铁皮石斛纯多糖及各分级组分分子量、粘度等参数。

色谱条件:色谱柱:SB-804 HQ(Shodex OHpak,8.0 mm ID×300 mmL)和SB-806 HQ(Shodex OHpak,8.0 mm ID×300 mmL)串联。色谱柱和检测器温度均为35 ℃,流动相为含有0.02%的NaN3的0.1 mol/L NaNO3溶液,流速0.6 mL/min,样品浓度1 mg/mL,进样量100 μL,ASTRA 6.1软件采集并分析数据。

1.2.2.5 铁皮石斛纯多糖分级组分的均一性检测 采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对铁皮石斛多糖分级组分的均一性进行检测。利用Agilent 1260 HPLC进行分析,色谱条件:流动相为0.02% NaN3溶液,流速0.6 mL/min;色谱柱UltrahydrogelTM Linear Column(300 mm×7.8 mm),RI 2410示差检测器均一性检测;检测器温度和柱温均为35 ℃,样品浓度为1 mg/mL,进样量为20 μL。

1.2.3 铁皮石斛纯多糖分级组分的体外免疫活性研究

1.2.3.1 CCK-8法检测RAW264.7细胞的活力 将RAW264.7细胞个数调整为4×104个/mL,接种于96孔细胞培养板中(0.1 mL/孔),将96孔细胞培养板于37 ℃含5% CO2培养箱中培养4 h,再分别加入终浓度均为40 μg/mL的F30、F40、F50和F50S样品。空白对照组,含有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液;阴性对照组,含有培养基和CCK-8溶液而没有细胞;以及LPS阳性对照组,混合溶液中LPS浓度为1 μg/mL。实验中各多糖组及对照组均设置10个复孔,在37 ℃含5% CO2的培养箱中培养24 h,然后加入10 μL的CCK-8试剂,1.5 h后终止培养,测定450 nm处OD值。细胞活力按公式(1)进行计算:

式(1)

式中,A1:含有细胞、CCK-8溶液和药物溶液孔的吸光度值;A0:阴性对照孔的吸光度值;A2:空白对照孔的吸光度值。

1.2.3.2 RAW 264.7细胞NO释放的测定 将RAW264.7细胞按5×105个/孔接种于96 孔细胞培养板中,给药方式同1.2.3.1,同时设置LPS阳性对照孔和空白对照孔。24 h后收集细胞培养上清液,参照NO检测试剂盒说明书测定NO含量。

1.2.3.3 ELISA法检测细胞分泌TNF-α、IL-1β将RAW264.7细胞个数调整为5×106个/mL,分别加入0.1 mL悬浮液于96孔细胞培养板中,给药方式同1.2.3.1,同时设置1 μg/mL的LPS阳性对照孔和空白对照孔,然后加入培养基至总体积为0.2 mL,培养24 h后1000 r/min条件下离心5 min收集上清。应用ELISA试剂盒测定RAW264.7细胞分泌的TNF-α、IL-1β细胞因子的量,具体操作按照ELISA试剂盒步骤。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛多糖分级组分化学成分分析

铁皮石斛纯多糖DOP及各分级组分的化学成分分析结果如表2所示。

表2 铁皮石斛纯多糖及分级组分化学成分分析

从表2中可知,各组分中性糖含量与DOP相比都具有显著性差异(p<0.05),其中F40和F50组分中含量较高,而F50S组分中含量较低,表明各分级组分并不完全是由中性糖构成;各组分糖醛酸含量较DOP均有所降低。各组分蛋白质含量与DOP相比都具有显著性差异(p<0.05),其中F40组分中蛋白质含量极低,在本方法中未检测到。

2.2 铁皮石斛多糖分级组分分子量及单糖组成分析

铁皮石斛纯多糖DOP及其分级组分的分子量及单糖组成分析结果如表3所示。从表3中可知,随乙醇浓度的增加,分级组分的重均分子量、数均分子量和固有粘度均逐渐降低,而Mw/Mn则逐渐增加。Mw/Mn称为高聚物的分子量分散指数,其数值表征了高聚物分子量的分部宽度。其值越大,则表明分子链分布越宽,多分散性越高。由单糖组成结果可知,DOP及各分级组分均主要由甘露糖和葡萄糖组成,但在比例上存在差异,表明各组分均主要为葡甘露聚糖,其中F50S组分中还含有少量的半乳糖。从表3中可知,F30、F40、F50和F50S各组分中Man与Glc的摩尔比例逐渐增加,其可能的原因是醇沉时先沉淀出大分子,而这些大分子主要是DOP的主链结构,后沉淀出支链结构,而支链结构中连接有半乳糖醛酸,所以Man与Glc的摩尔比例逐渐增加。

表3 DOP、F30、F40、F50 和F50S的分子量及单糖组成

2.3 铁皮石斛多糖分级组分的均一性检测

铁皮石斛纯多糖DOP及其分级组分的HPGPC图谱如图1所示。

图1 DOP、F30、F40、F50及F50S的HPGPC图谱

从图1中可知,DOP及F30、F40、F50和F50S均只含一个主要的色谱峰,峰型对称且较窄,表明DOP及各分级组分均一性较好。与其他组分相比较,F50S的峰最宽,表明其多分散性最高。这与分子量分析结果相符合。

2.4 铁皮石斛多糖分级组分对RAW264.7巨噬细胞活力的影响

如图2所示,与空白对照组相比,DOP、F30、F40、F50和F50S组均能显著促进RAW264.7细胞的生长(p<0.05)。与DOP组相比,F50S组对RAW264.7巨噬细胞的活力影响较强(p<0.05),而F30、F40组对RAW264.7巨噬细胞的活力影响较DOP组弱(p<0.05)。分子量被认为是决定多糖免疫调节活性中最重要的一个参数,分子量为100 kDa左右的多糖有着较好的免疫调节活性[33]。F50S组分的分子量为136.2 KDa,因此相比与其他组分其对RAW264.7巨噬细胞的活力有较显著的作用。

图2 DOP、F30、F40、F50及F50S对RAW264.7巨噬细胞活力影响

2.5 铁皮石斛多糖分级组分对RAW 264.7巨噬细胞释放NO的影响

NO是巨噬细胞产生的主要效应分子,同时也是巨噬细胞被激活的重要标志。铁皮石斛多糖分级组分对RAW 264.7巨噬细胞释放NO的影响如图3所示。

图3 DOP、F30、F40、F50及F50S对RAW264.7细胞分泌NO的影响

图3表明,与空白对照组相比,铁皮石斛多糖分级组分均显著促进了RAW264.7巨噬细胞NO的释放(p<0.05)。与DOP组相比,F30、F40、F50组对RAW264.7巨噬细胞NO的释放作用较DOP组弱(p<0.05),而F50S组较DOP组强(p<0.05),再次验证铁皮石斛多糖与其分级组分能增强体外免疫活性,且分子量能显著影响多糖的免疫调节活性,分子量较小的,免疫调节活性较强。

2.6 铁皮石斛多糖分级组分对RAW 264.7巨噬细胞释放TNF-α、IL-1β的影响

图4、图5表明,与正常对照组相比,铁皮石斛纯多糖及各分级组分均能显著促进RAW264.7巨噬细胞TNF-α的分泌(p<0.05)。与DOP组相比,F30、F40、F50组对RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α的作用较DOP组弱(p<0.05),而F50S组较DOP组强(p<0.05);与正常对照组相比,F30、F40组的IL-1β分泌量均无显著性变化(p>0.05),而DOP及F50、F50S组均能显著促进RAW264.7巨噬细胞IL-1β的分泌量(p<0.05)。与DOP组相比,F50S组对RAW264.7巨噬细胞分泌IL-1β的作用较DOP组强(p<0.05)。巨噬细胞表面有着许多不同的模式识别受体,它们能识别不同的外来分子从而引起不同的免疫反应[34]。因此铁皮石斛多糖及各分级组分对RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α及IL-1β可能是通过不同而又特定的多糖受体来实现不同的免疫反应,因此会有差异性,但总体来说分子量较小的,其免疫调节活性较好。

图4 DOP、F30、F40、F50及F50S对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响

图5 DOP、F30、F40、F50及F50S对RAW264.7细胞分泌IL-1β的影响

3 结论

铁皮石斛纯多糖及其分级组分均主要为中性糖。分子量及均一性分析表明DOP、F30、F40、F50、F50S分子量分别为262.4、314.5、248.3、202.9和136.2 kDa,且各组分均一性良好。单糖组成分析表明DOP及各分级组分均主要由甘露糖和葡萄糖组成,其甘露糖与葡萄糖的摩尔比逐渐增加。体外免疫活性研究表明DOP及各分级组分均能显著促进体外免疫调节活性,能使RAW264.7巨噬细胞的增殖作用、NO的释放和TNF-α及IL-1β的分泌均显著性增加,其分子量较小的,免疫调节活性较好。巨噬细胞表面有着许多不同的模式识别受体,它们能识别不同的外来分子从而引起不同免疫反应。因此铁皮石斛多糖及各分级组分对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节可能是通过不同而又特定的多糖受体来实现不同的免疫反应。多糖的免疫调节活性与其化学组成、分子量大小、构象、糖苷键的连接方式、支链的数量有关,分子量被认为是决定多糖免疫调节活性中最重要的一个参数。因此本研究中铁皮石斛多糖及各分级组分因其结构的不同而使得其对RAW264.7巨噬细胞呈现不同免疫调节活性。本研究为铁皮石斛多糖分级组分在提高免疫力方面提供了一定理论基础,但是否在体内也有相同的作用及其免疫调节的机制还尚未明确,有待于进一步的深入研究。