刘佩，于文江，郑红

（山东省食品药品检验研究院，山东济南250103）

食用色素能够改善食品色泽，是食品添加剂的一个重要组成部分，在食品加工业中具有十分重要的地位。按其来源和性质，食用色素分为天然色素和合成色素，天然色素安全对环境无污染[1]，但稳定性较差。合成色素价格便宜、着色力强、稳定性好，目前在食品加工方面应用广泛，但是合成色素大多属于偶氮类化合物，对人体健康存在一定的不安全性。我国允许在食品中添加的合成色素有苋菜红、胭脂红、柠檬黄、新红、赤藓红、日落黄、亮蓝、酸性红、喹啉黄、靛蓝及其铝色淀。而根据我国GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[2]规定，它们禁止用于新鲜水果。

目前，食品中人工合成色素的检测方法主要有高效液相色谱法[3-7]、紫外分光光度法、高效液相色谱-串联质谱法[8,9]、毛细管电泳法[10]、极谱法[11]和薄层色谱法等。由于水果本身含有大量的天然色素，建立一种针对水果中多种人工合成色素同时检测的方法是十分必要的。文章对水果中易添加的柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红7种人工合成色素的测定方法进行了研究，建立了同时检测水果中违规添加的7种人工合成色素的高效液相色谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红（纯度>99.5%），国家标准物质研究中心。甲醇（色谱纯），德国Merck公司。醋酸铵（分析纯），上海国药集团。Waters 2695高效液相色谱仪，包括在线真空脱气机、四元高压梯度泵、自动进样器、恒温柱温箱、二极管阵列检测器，美国沃特世公司；MS204S电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DHG-9075A电热鼓风干燥箱，上海和羽良电子科技有限公司；Milli-Q IQ7000型超纯水机，美国Millipore公司；SB-800 DTD超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

准确称取粉碎过的新鲜水果样品5g至25mL比色管中，加入20mmol/L醋酸铵水溶液15mL，超声提取15min，用20mmol/L醋酸铵水溶液定容至刻度，混合摇匀，经过0.45μm滤膜过滤，待测。

1.2.2 标准溶液的配制

准确称取柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红各50.0mg，加超纯水溶解并定容至50mL，此标准溶液浓度为1.0mg/mL。将上述标准溶液进行稀释，配制成 5、10、20、40、80、100μg/mL 的混合标准工作溶液。

1.2.3 色谱条件

流动相：A-20mmol/L醋酸铵溶液，B-甲醇。流速：0.8mL/min。色谱柱：C18（3.5μm，4.6mm×150mm），柱温：35℃，检测波长：254nm，进样量：10μL，梯度洗脱。

1.2.4 定性定量测定

将经过前处理的水果样品，进样经HPLC分析。采用标准物质的保留时间和目标物光谱图对样品峰进行定性，采用外标法以峰面积计算定量。浓度的柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红使用7种合成色素混合标准溶液进样分析，以质量浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算出样品中各种色素的含量。

2 结果与分析

2.1 流动相选择及优化

目前高效液相色谱检测流动相主要是甲醇和乙腈，试验分别考察了甲醇-甲酸铵、乙腈-甲酸铵、甲醇-醋酸铵、乙腈-醋酸铵4种流动相体系对7种色素的分离效果。综合考虑分离度、样品的分析时间和目标组分峰形，选用甲醇-醋酸铵为流动相，梯度洗脱程序见表1。分离后的标准物质色谱图见图1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure for mobile phase

图1 标准物质色谱图Fig.1 Chromatogram of standard substance

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围和检出限

在优化好的试验条件下，绘制标准曲线，以基线噪声10倍峰面积对应的质量浓度为定量限，线性范围、回归方程、相关系数、定量限见表2。由表2可以看出，在0～100μg/mL的浓度范围内，7种合成色素的峰面积与浓度呈良好的线性关系。

表2 7种合成色素的线性范围、回归方程、相关系数及定量限Table 2 Linear range,regression equation,correlation coefficient and quantitative limit of 7 synthetic pigments

2.2.2 精密度实验

取一空白水果样品加标（0.10mg/kg），重复进样6次，计算出精密度，7种合成色素的相对标准偏差（RSD）为2.8%～3.6%，精密度良好。

2.2.3 加标回收率实验

在空白水果样品中，各色素添加水平均为0.050mg/kg、0.20mg/kg，按优化好的样品处理方法处理，每个浓度做6个平行，加标回收率为95.8%～103.9%。

3 结论

通过试验建立了水果中柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红7种人工合成色素的高效液相色谱检测方法。方法加标回收率95.8%～103.9%，相对标准偏差 2.8%～3.6%（n=6），检出限为 0.015～0.025mg/kg。方法的测定快速准确，适用于水果中多种人工合成色素的同时检测。