乔峰，王敬民，李敬华，程栋，刘艳红，石瑜

（淄博市农业科学研究院，山东淄博255000）

根结线虫（Meloidogynespp.）能够侵染热带和温带植物的根系，是世界上对植物破坏性最大的病原体之一[1]。由于温室多年连作或购买带线虫苗木等原因，使温室土壤中根结线虫增多，严重危害了蔬菜、果树等经济作物的产量和品质。目前生产上比较认可的防治方法是栽培持续高抗的蔬菜、果树品种。因此，在果树育种过程中需要一种简便、快速、准确的鉴定抗性品种方法，本文介绍了不同的接种源和不同接种源的获取方法，以及它们对根结线虫抗性筛选的影响和常用的抗性鉴定方式，如一般接种、高持续性接种等。分析了适用于果树的发根农杆菌介导的组织培养接种，并指出抗线虫植株鉴定筛选的趋势是向快速、简便、准确的分子标记方向发展。

1 接种源及其获取方法对根结线虫抗性筛选的影响

一般根结线虫的接种源分为卵块、卵、二龄幼虫，由于卵块的收集时间较长，且每个卵块中卵的数量不同，较难形成统一的接种标准；接种时，卵块为块状，不易均匀分散在果树根系周围；另外，其他病原体和根腐病菌易通过卵块侵染植物，引起病害。接种二龄幼虫时，要确保获得接种源后及时接种，以防止幼虫死亡或侵染力下降；同时，需保证二龄幼虫适宜的生存环境，防止二龄幼虫死亡或侵染力下降。卵的获取较方便快捷，可通过NaClO溶液冲洗获得[2]；获取过程中，卵的表面得到消毒，不会携带病原体；接种时，通过制定一定浓度的悬浮液，保证统一接种量，且可均匀侵染果树根系。

不同的接种源获取方法对抵抗根结线虫的侵染有一定的影响。根据Hussey 1973的报道，用离心机或机械粉碎获得卵的方法对其孵化和侵染力都有一定的破坏作用，如卵的孵化率降低和卵的数量减少[2]；在潮湿环境中，孵化的根结线虫侵染率更低。用1.05%NaClO溶液冲洗[2]获得卵的方法对其孵化和侵染力影响较小，并证明用1.05%NaClO溶液冲洗收集到的卵作为接种源最合适。

2 鉴定方式

2.1 接种方式

2.1.1 一般的接种方法

在鉴定筛选抗性果树植株时，常用含有一定数量的二龄幼虫悬浮液接种。通过控制每株接种二龄幼虫悬浮液的浓度和体积控制接种量。具体操作方法如下：用移液枪在距离植株茎基部1cm左右，注射到2cm深的小孔中[3]，7d后观察植株根系的变化，包括根结数量、根结指数，或30d左右测定每株根系中卵、二龄幼虫或雌虫数量（线虫的数量可通过酸性品红染色的方法计数），从而确定植株的抗性级别。木本植物中，常用根结指数分级标准[4]（表1），在分级的基础上，计算病情指数并确定抗性级别。该方法简便、快速，接种量标准统一，但在筛选抗性果树植株中不容易区分出高抗植株。

表1 抗性分级标准Table 1 Grading standard of resistance

2.1.2 高持续性接种

高持续性接种能够明显区分出高抗植株，通过连续大量的对筛选植株接种，获得的抗性植株较准确。具体操作如下：在接种前，培育大量感病的番茄苗，当番茄长到5叶龄时，接种500条二龄幼虫；2个月后，部分番茄苗去掉地上部分，把其根系和土壤整体移到被鉴定植株的营养钵内，一段时间后，测定根结数等指标；剩余番茄苗作对照，去掉地上部分，每隔一段时间测定土壤和番茄根系内线虫和卵的数量，从而确定各个时期的接种量[5]。高持续性接种保证了接种根结线虫的持续性，能够较好地区分高抗植株，但接种数量不易被确定或不准确。

2.2 离体抗性鉴定及其改进

2.2.1 离体抗性鉴定

果树根系生长时间长，如果用常规育苗方式，如绿枝扦插、硬枝扦插等，一年中只能繁育2～3批鉴定的果树苗木，严重影响植物抗性鉴定的进度。组织培养育苗能够实现周年育苗，确保为抗根结线虫的鉴定提供充足植株。组织培养育苗后，通过炼苗移栽然后鉴定其抗性，或直接在培养基中接种根结线虫鉴定其抗性。

组织培养育苗鉴定根结线虫抗性时，需确定外源生长素是否对组织培养获得的植株产生抗性修饰，导致其抗性消失或增强。有文章已报道桃树在组织培养过程中受外源萘甲酸的影响，其抗性降低[6]，但Esmenjaud等[5]证明通过组织培养获得的紫叶李对根结线虫的抗性不受外源激素影响。因此，在利用组织培养扩繁抗性鉴定植株时，需要鉴定生长素及其不同浓度对扩繁植株抗性的影响，才能鉴定其抗性。结合组织培养的方式鉴定植株对根结线虫的抗性，能够缩短鉴定时间，且在一年内可多次育苗，实现多次鉴定。

2.2.2 培养基内抗性鉴定

在土壤中很难观察果树根系对根结线虫的抗性程度，且不能直接观察根结线虫的侵染过程。培养基内鉴定植株对根结线虫的抗性能够观察到根结线虫的侵染过程及发病情况，但需要排除外源激素、培养基等因素的影响，并且植株能够快速生长出大量根系。1991年，Sijmons等人[7]在培养基中鉴定植株对根结线虫的抗性以及观察根结线虫的侵染过程，筛选出易被根结线虫侵染的拟南芥和适宜根结线虫侵染的培养基，确定了生根培养基—Knop（1860）对根结线虫的侵染不会产生影响，并证明蔗糖的浓度及质量和培养基的硬度都会影响到根结线虫的侵染效率。利用拟南芥根系细并且透明的特点，在培养基中能够观察到根结线虫的侵染和生长发育过程。该方法证实在培养基内鉴定植株对根结线虫抗性和观察根结线虫在植株根系中生长发育的可行性，表明在室内能够实现一年多次对植株根结线虫抗性的鉴定。

果树植株生根较慢，可通过发根农杆菌促进植株在培养基内快速生根[8]，实现培养基内快速鉴定。2006年，Alpizar等[9]向咖啡树中转入发根农杆菌，促使植株快速生长出大量毛状根，鉴定其对根结线虫的抗性，证明发根农杆菌不会改变植株对根结线虫的抗性。2011年，Bosselut等[10]鉴定紫叶李对根结线虫抗性时，也通过发根农杆菌侵染紫叶李促使其发根并在培养基中接种根结线虫，鉴定其抗性。以上试验说明发根农杆菌能够促进组培苗生根且不影响植株对根结线虫的抗性鉴定。

3 小结

抗根结线虫植株的筛选是一个复杂的过程，筛选植株的方法已经从田间鉴定发展到试验室内，但也需要准确的抗性评定标准。抗性的评定指标很多，如根结指数、每克根中雌线虫数、二龄幼虫数、卵数和总的线虫数量等，这些指标均是形态学上的分析评定，对极抗病植株和极感病植株的判断较准确，但是对中间类型的判断比较模糊。考虑到从育苗到接种，再到抗性评价整个过程的繁琐性，需要从分子层面准确的鉴定植株抗性。相信随着分子技术地不断发展与成熟，以及抗性基因的发现，从分子方面快速准确的鉴定抗性是一种发展趋势。