杨迪 赵新仕 邹婷婷 王赟 周业皓 杜戈

摘要：  为建立‘杨氏金红50号猕猴桃的离体快繁体系，该研究以其带腋芽茎段为外植体，采用组织培养的方法进行离体培养，并建立了两种离体再生途径：途径I为直接诱导茎段腋芽出芽;途径Ⅱ为茎段基部先产生愈伤组织，再分化不定芽。结果表明：‘杨氏金红50号猕猴桃带腋芽茎段的最佳灭菌方式为75%酒精30 s+ 15% Ca（ClO）2 5 min+ 0.1%升汞8 min;在途径I中，诱导茎段腋芽出芽的最优培养基为MS+ 4.0 mg·L-1 6-BA+ 0.1 mg·L-1 NAA;在途径Ⅱ中，诱导茎段基部产生愈伤组织并产生不定芽的最优培养基为MS+ 3.0 mg·L-1 6-BA+ 0.3 mg·L-1 NAA;培养丛生芽的最佳植物生长调节剂组合为MS+ 4.0 mg·L-1 6-BA+ 0.4 mg·L-1 NAA;不定芽生根培養的最佳植物生长调节剂组合为1/2 MS+ 0.9 mg·L-1 IBA，20 d左右分化出不定根，40 d左右获得完整植株;生根后的组培苗在田园土∶细沙=1∶1的基质中能达到96%的移栽成活率。-

关键词： ‘杨氏金红50号猕猴桃， 带腋芽茎段， 组织培养， 植物生长调节剂， 再生体系-

中图分类号：  Q945

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2018）12-1667-08---

广西植物38卷

12期

杨迪等： ‘杨氏金红50号猕猴桃的离体快繁研究

收稿日期：  2018-01-15-

基金项目：  河南省科技攻关项目（102102110159）;南阳师范学院2018年度STP项目（2018STP001）;南阳师范学院2017年度研究生创新基金（2017CX007） [Supported by the Scientific and Technological Research Program of Henan Province （102102110159）; STP Program of Nanyang Normal University in 2018 （2018STP001）; Graduate Student Innovation Fund of Nangyang Normal University in 2017 （2017CX007）]。-

作者简介： 杨迪（1993-），男，河南南阳人，硕士研究生，从事植物资源保护与利用等研究，（E-mail）amazingdaliyang@163.com。-

*通信作者：  张乃群，教授，从事植物资源保护与利用等研究，（E-mail）zhnq@nynu.edu.cn。

Micropropagation in vitro of Actinidia chinensis -‘Yangshi Jinhong 50

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YANG Di1， ZHAO Xinshi1， ZOU Tingting1， WANG Yun1， ZHOU Yehao1， -DU Ge2， LI Shulin2， ZHANG Naiqun1*

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（ 1. College of Life Sciences and Technology， Nanyang Normal University， Nanyang 473061， Henan， China;-2. Institute of Actinidia Chinese in Xixia County， Xixia 474573， Henan， China ）

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Abstract：  In order to establish the rapid and efficient propagation system in vitro， we used stem with axillary bud of Actinidia chinensis ‘Yangshi Jinhong 50 as the explant， and used tissue culture to study suitable explants sterilization method， best plant growth regulator combination in Actinidia chinensis ‘Yangshi Jinhong 50. We established two kinds of in vitro regeneration modes. Mode I： the axillary buds of stem with axillary bud were induced directly; Mode Ⅱ： the callus was induced first， and then the adventitious buds were induced. The results showed that the best sterilization method for stems with axillary buds was 75% alcohol 30 s + 15% Ca（ClO）2 5 min+ 0.1% mercuric chloride 8 min; In Mode I， the plant growth substances combination of MS + 4.0 mg·L-1 6-BA+ 0.1 mg·L-1 NAA for axillary bud germination had the best the induction rate; In Mode Ⅱ， callus rate of inducing stem bottom was more than 80%， the optimal medium that induced stems bottom callus to generate adventitious buds was MS+ 3.0 mg·L-1 6-BA+ 0.3 mg·L-1 NAA; the best plant growth substances combination in tufted bud culture was MS+ 4.0 mg·L-1 6-BA+ 0.4 mg·L-1 NAA; the best plant growth substances combination in rooting culture was 1/2 MS+ 0.9 mg·L-1 IBA， getting the differentiation of adventitious root about 20 d and complete plant 40 d. After the seedlings rooted， transplanted the seedlings to the substrate， the seedlings reached the 96% survival rate in the substrate with the garden soil∶sand = 1∶1. Through this study， the micropropagation system in vitro of Actinidia chinensis ‘Yangshi Jinhong 50 was established， which provides the basis for the research of genetic transformation in Actinidia chinensis Planch.-

Key words： Actinidia chinensis ‘Yangshi Jinhong 50， stems with axillary buds， tissue culture， plant growth regulator， regeneration system

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猕猴桃作为20世纪人工驯化栽培野生果树最有成就的四大果种之一（Warrington & Weston，1990），其茎段（王林青，2017）、花药（王广富，2017）、叶片（韦鹏飞，2016）、叶柄（葛新玲，2009）、胚乳（林穎等，2012）等都曾被用作组织培养的研究，组织培养技术已经成为猕猴桃良种繁育的重要途径。

中华猕猴桃（Actinidia chinensis）是中国特有的猕猴桃果种，口感独特，经济价值高，近年来种植规模逐步扩大（王茹琳等，2018）。‘杨氏金红50号猕猴桃（Actinidia chinensis ‘Yangshi Jinhong 50）是2013年由江苏省扬州杨氏猕猴桃科学研究所从中华猕猴桃中选育出来的优良品种，果实单果重量平均在100 g以上，金肉红心，不仅好看而且甜度高、果肉细腻、口感好，被认为是有望超越‘海沃德的新品种。西峡县是中国重要的猕猴桃产区，种植了大量的‘杨氏金红50号猕猴桃且销量好、农户评价较高、市场前景广阔。现阶段西峡县采用的育苗方法主要为实生苗嫁接法，即以种子繁育的实生苗为砧木，在其上嫁接人工栽培品种。该方法需先利用一年时间培育出实生苗作为砧木，然后再利用一年时间管护嫁接苗生长，育苗周期为两年左右（唐玲玲等，2016），时间长且易感染溃疡病，对西峡县的猕猴桃产业发展有一定限制。目前，虽然关于猕猴桃组织培养有一定的报道，但猕猴桃雌雄异株，基因高度杂合，组织培养体系受到基因型的影响（黄宏文等，2000），且关于‘杨氏金红50号的组织培养尚未见有相关研究报道。因此，本研究采用杨氏金红50号猕猴桃的带腋芽茎段进行组织培养，为西峡县科学种植‘杨氏金红50猕猴桃提供了技术支撑。

1材料与方法

1.1 材料

试验材料在西峡县猕猴桃研究所试验田采集，取材时间为5月，取健康、幼嫩的‘杨氏金红50号猕猴桃新梢茎段为外植体。

1.2 培养基成分及培养条件

腋芽诱导、愈伤组织诱导、芽的分化、丛生芽培养均以MS为基本培养基，生根培养以1/2 MS为基本培养基，含36 g·L-1蔗糖、6 g·L-1琼脂、pH为5.8～6.2之间，用到的植物生长调节剂有6-BA、NAA、IBA，培养基于121 ℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min。培养温度为（25±2）℃，光照强度为1 500～2 000 lx，光照时间为每天12 h左右。

1.3 方法-

1.3.1 外植体的灭菌将‘杨氏金红50号猕猴桃的幼嫩枝条去除叶片，用洗洁精洗净，并在自来水下冲洗40 min，截成1～1.5 cm长的带腋芽茎段，再分别用4个处理进行灭菌。每个处理接种30个，21 d时分别统计污染率、褐化率、成活率。成活率=1-污染率-褐化率。灭菌后的带腋芽芽茎段用无菌水冲洗5～6次，洗去灭菌剂残留和灭菌过程中茎段的分泌物，每个处理接种30个外植体。由于‘杨氏金红50号猕猴桃茎段表层长有细密的毛，灭菌处理时应用无菌镊子反复搅动，以便于灭菌剂充分接触茎段表皮。-

1.3.2 腋芽培养经灭菌处理的带腋芽茎段需先剪去两端与灭菌剂接触的伤口部分，再分别接种于添加不同植物生长调节剂的MS培养基中，腋芽朝上，培养35 d后统计腋芽的萌发率及数量。共设9种培养基，每种培养基8个外植体，重复3次。出芽率=出芽的外植体数/接种的外植体数SymboltB@100%。-

1.3.3 愈伤组织不定芽诱导在腋芽诱导的过程中，茎段基部会产生愈伤组织，每隔一周观察记录一次每种培养基茎段愈伤组织的变化情况，并统计愈伤组织再分化成芽的诱导率。愈伤组织再分化成芽的诱导率（表3中的出芽率）=愈伤组织出芽的外植体数/接种的外植体总数SymboltB@100%。-

1.3.4 丛生芽培养选择健壮且生长状况基本一致的单个不定芽接种于增殖培养基上做丛生芽培养，每隔10 d观察一次芽的生长情况，30 d后统计不定芽的增殖率及增殖系数。共设9种培养基，每种培养基7个不定芽，重复3次。增殖系数为单个外植体再生形成的芽的平均数。-

1.3.5 不定芽生根选取长至2～3 cm且健壮、生长情况基本一致的单个不定芽接种于生根培养基上做生根培养。共设6种培养基，每种培养基7个不定芽，重复3次，每隔10 d观察记录一次数据。生根率=生根的不定芽数/接种的不定芽数SymboltB@100%。-

1.3.6 生根苗移栽生根后的无菌苗，移至在日光温室中炼苗，先拧松瓶盖放置2 d，再打开培养瓶瓶盖，放置5 d左右，之后洗净根部的培养基，移栽至田园土∶细沙= 1∶1的基质中。

1.4 数据分析

所有数据先用Excel 2013做初步统计，再用SPSS 22.0软件进行统计学分析，平均数之间差异显著性比较采用Duncan法（新复极差法）。

2结果与分析

2.1 不同灭菌方法获取‘杨氏金红50号猕猴桃无菌带芽茎段

经过20 d的观察，污染多出现在前9 d，褐化则是在7～20 d之间陆续出现，4种灭菌方法对‘杨

氏金红50号猕猴桃带芽茎段的处理效果有较大的差异，如表1所示。C处理仅用Ca（ClO）2灭菌，污染率最高，达到70.00%，成活率最低，而另外3种使用升汞的处理污染率均在50%以下，说明本试验中升汞灭菌效果更好;A处理是升汞灭菌5 min，B处理是升汞灭菌8 min，A处理污染率比B处理高13.34%，成活率低10.02%，说明升汞灭菌

8 min效果比5 min好;D处理是Ca（ClO）2和升汞结合灭菌，污染率比B处理低10.00%，成活率高3.24%，效果略优。外植体褐化现象是由外植体被切割后，破裂溶酶体中的酚氧化酶把细胞质中的酚氧化为醌产生的。综合考虑，‘杨氏金红50号猕猴桃带芽茎段灭菌的最佳处理为75%酒精30 s+ 15% Ca（ClO）2 5 min+ 0.1%升汞8 min。

2.2 ‘杨氏金红50号猕猴桃腋芽的诱导

带腋芽茎段接种后，培养7 d左右腋芽开始萌发，13 d左右可看到明显的呈浅绿色的小芽，随着培养的继续，腋芽逐渐变成深绿色，35 d后，最高的出芽率达91.67%（表2），芽的高度在2～5 cm之间。由表2可知，当培养基中6-BA浓度为3～5 mg·L-1时，0.1 mg·L-1的NAA浓度最适合腋芽萌发，3种培养基中外植体的腋芽出芽率均在75%及以上。其中，2号培养基中外植体出芽率高达91.67%，显著高于其余8种培养基，且芽健壮，茎、叶明显，生长旺盛（图1：A）;6号培养基中外植体的出芽率达79.17%，苗弱、细，叶片长势很好，茎短，不能正常伸长;从整体上来看，随着NAA浓度由0.1 mg·L-1升至0.3 mg·L-1，对腋芽的出芽有抑制作用。因此，本研究得到的‘杨氏金红50号猕猴桃茎段腋芽萌发的最佳培养基为MS+ 4.0 mg·L-1 6-BA+ 0.1 mg·L-1 NAA。

2.3 ‘杨氏金红50号猕猴桃茎段基部愈伤组织的不定芽分化

9种培养基中接种的‘杨氏金红50号猕猴桃茎段基部均能大量形成愈伤组织（图1：B），出愈率均在80%以上，但愈伤组织再分化成不定芽的过程较慢，前7 d外植体底端明显膨大，7～15 d之间形成愈伤组织，1月后愈伤组织才能再分化出芽，在1～3个月之间愈伤组织会陆续长出不定芽。其中，7号培养基，即3 mg·L-1 6-BA+ 0.3 mg·L-1

NAA出芽最快，出芽率最高，出芽时间在前2个月，出芽率达83.33%，芽粗壮，长势良好（图1：C）;而1号培养基，即3 mg·L-1 6-BA+ 0.1 mg·L-1 NAA，出芽率虽然也高达75.00%，但整体出芽时间多为第2个月和第3个月，属后期出芽;其余

7种培养基出芽率与上述两种差异显著（P<0.05）。结合表3可知，6-BA和NAA的浓度配比对茎段愈伤组织的诱导情况及愈伤组织再分化成芽的诱导率影响显著，NAA浓度不变时，随着6-BA浓度的升高，愈伤组织产生不定芽的诱导率呈下降趋势，6-BA浓度为5 mg·L-1时，出愈率虽然高，但出芽率却极低，6号培养基除少量芽分化外还有少量不定根分化，9号培养基的出芽率为0。因此，‘杨氏金红50号猕猴桃茎段愈伤组织诱导及再分化形成不定芽的最佳培养基为MS+ 3 mg·L-1 6-BA+ 0.3 mg·L-1 NAA。

2.4 ‘杨氏金红50号猕猴桃丛生芽培养

在丛生芽培养过程中，8 d左右在芽底部的茎上会先长出少量愈伤组织，在愈伤组织上会出现芽点，13～17 d便可观察到丛生芽的长出。根据表4可知，5号培养基的增殖效果最好，平均增殖系数达6.14（图1：D），与其余的培养基有极显著差异（P<0.01）;8號培养基平均增殖系数为5.10，比5号培养基稍差一点;7号培养基最差，只有个别不定芽增殖。试验发现，在NAA浓度不变时，随着6-BA浓度的升高，增值系数出现“低- 高- 低”的变化，可见，6-BA浓度为 4.0 mg·L-1适合‘杨氏金红50号猕猴桃丛生芽培养，相匹配的3种NAA浓度，0.4 mg·L-1时效果最佳。所有培养基在植株的基部均有愈伤组织的形成，3、6、9号培养基基部的愈伤团较大;3、6号培养基共出现3个玻璃化芽;1号培养基增殖的不定芽颜色偏黄，长势畸形。因此，‘杨氏金红50号猕猴桃的最佳丛生芽培养基为MS+4 mg·L-1 6-BA+0.4 mg·L-1 NAA。

2.5 ‘杨氏金红50号猕猴桃不定芽的生根

不定芽在生根培养基中，12 d左右在芽底部的茎上出现根点，从第18天开始产生不定根，第22天普遍生根，之后不定根伸长，在40 d左右形成良好的根系。根据表5可以看出随着IBA浓度的升高，‘杨氏金红50号猕猴桃不定芽的生根情况有显著差异。除3号培养基外，整体培养基的生根率、平均生根数、平均根长均随着IBA浓度升高而变化，在0.9 mg·L-1 IBA处理时达到最大值，株高则随着IBA浓度升高而降低。0.9 mg·L-1 IBA处理的生根率最高（72.64% ）、平均生根数较多（25.67条 ）、根

长较长（2.67 cm ）（图1：E），其次是1.1 mg·L-1 IBA处理，0.3、0.7 mg·L-1 IBA处理两个处理生根率还不到40%，平均生根数及根长亦较差。因此，‘杨氏金红50号猕猴桃不定芽最佳的生根培养基为1/2 MS+ 0.9 mg·L-1 IBA。

2.6 生根苗移栽

生根苗经1周左右的炼苗，移栽至配好的基质中，再经40 d的观察，成活率达到96%以上，根系发达，适合进行田园种植（图1：F）。

3讨论

激素的配比对组织培养起着决定性的作用，不同种类或浓度的激素对外植体生长和分化有不同的作用（黄奥丹等，2017;闫海霞等，2017）。关于诱导腋芽萌发，前人的研究不尽相同。同为中华猕猴桃系列品种的‘红阳猕猴桃的最佳激素组合为1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，萌发率达83.33%（隆前进等，2010）;‘脐红猕猴桃的最佳激素组合为2.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，萌发率达82.64%（王林青，2017）;‘Hort 16A猕猴桃的最佳激素组合为3.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，萌发率达85.15%（王林青，2017）;本试验利用较高浓度的6-BA和较低浓度的NAA结合，腋芽萌发率为91.67%，高于上述三个品种，这可能是因为基因型的不同，导致不同品种所适应的激素浓度也不同。此外，还发现茎段基部易产生愈伤组织，再分化出不定芽时，6-BA对其影响明显，3.0 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 NAA时出芽率达83.33%，诱导过程不需更换培养基，这与常用的先用2，4-D诱导愈伤组织，再用6-BA或ZT结合NAA诱导不定芽（张太奎等，2017）更省时省力，这可能是由于‘杨氏金红50号猕猴桃本身长势较好。关于丛生芽培养，刘峥等（2013）在总结猕猴桃组织培养研究进展时认为高浓度的6-BA对猕猴桃的不定芽增殖有促进作用，却会抑制茎的伸长。本研究得出丛生芽培养阶段最佳的6-BA使用浓度为4.0 mg·L-1，属于较高浓度，发现接种的不定芽虽有较高的增殖系数，但却出现叶片生长过旺，茎生长缓慢的现象，不利于进一步的生根培养，这与刘峥等（2013）的观点类似，具体原因有待于进一步试验探索。诱导不定芽生根时， 吴秀

华等（2013）通过比较NAA、IBA对‘海沃德猕猴桃生根的影响，得出IBA效果更优的结论;赵许朋等（2013）仅用IBA诱导‘红阳猕猴桃生根，也取得了很好的效果。本研究发现合适的IBA浓度可有效促进‘杨氏金红50号猕猴桃生根，其作用只在一定范围内有效。

本研究采用两种途径获得‘杨氏金红50号猕猴桃的无菌苗：一是诱导带芽茎段腋芽萌发，二是诱导茎段基部形成愈伤组织并产生不定芽。在已有的研究中，中华猕猴桃（谭晓明，2002）、软枣猕猴桃（林苗苗等，2016;牛晓林，2012）、狗枣猕猴桃（张玉杰，2014）成功构建了这两种途径的快繁体系;葛枣猕猴桃（王羽悦，2016）则通过带芽茎段腋芽萌发的途径建立了快繁体系;而大籽猕猴桃（姜维梅和李凤玉，2003）的愈伤组织分化成苗困难。上述研究均指出诱导腋芽萌发的快繁途径比通过茎段基部愈伤组织诱导不定芽的快繁途径更节省培养时间，效率更高，诱导腋芽萌发需35 d左右，而通过愈伤组织诱导不定芽的方式需2～3个月，时间过长。胡科迪（1991）用猕猴桃嫩梢为材料进行组织培养，指出诱导带芽茎段腋芽萌发的途径在遗传性状上更稳定，可保持母株优良性状，愈伤组织在分化过程中出现变异的可能性大。因此，直接诱导腋芽萌发的快繁途径是‘杨氏金红50号猕猴桃组培快繁的有效途径，通过愈伤组织产生的不定芽可为遗传转化研究提供基础。

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