黄晓慧 巫伟峰 陈春 张毅智 汪长水 徐建球 陈发兴 陈孝丑

摘要：【目的】优化中国兰的ISSR-PCR反应体系，并筛选适用于中国兰ISSR分析的候选引物，为ISSR分子标记在中国兰的辅助育种及亲缘关系和遗传多样性分析等提供技术参考。【方法】以6个中国兰品种为材料，采集其叶片样品，分别用研钵法和研磨仪法进行破碎研磨，比较两种方法提取DNA的效果，利用L25（53）正交试验和单因素试验对DNA模板量、引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、循环数和退火温度进行优化，建立最佳ISSR-PCR反应体系，并从ISSR分子标记通用引物中筛选适用于中国兰的ISSR分析候选引物。【结果】研磨仪法提取的DNA浓度明显高于研钵研磨法，但二者提取的DNA质量均较好（OD260/OD280为1.7～2.0）。对ISSR-PCR反应体系扩增结果的影响程度排序为DNA模板量>引物浓度>2×Taq Master Mix添加量。综合考虑成本和DNA模板量，最佳ISSR-PCR反应体系（20.0 μL）：DNA模板10.0 ng、引物0.8 μmol/L和2×Taq Master Mix 9.0 μL。最佳循环数为35，最佳退火温度为49.6 ℃。基于上述优化结果，从100条引物中共筛选出42条适用于中国兰的ISSR候选引物。【结论】研磨仪法可有效提高中国兰基因组DNA的提取率和质量，且利用优化后的ISSR-PCR反应体系和扩增程序及筛选出的引物，扩增获得的条带清晰、稳定，多样性好，可用于中国兰的遗传多样性和亲缘关系等分析研究。

关键词： 中国兰；ISSR；分子标记；反应；引物筛选

中图分类号： S682.310.36 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1282-07

0 引言

【研究意义】中国兰又称国兰，是中国传统兰花的统称，为兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）植物，其味幽香，花色淡雅，素有花中君子和天下第一香之美称，且具有独特的内涵和意境，观赏和经济价值很高（陈心启，2011）。中国兰约有50种，其中以地生兰为主，分为春兰（C. goeringii）、蕙兰（C. faberi）、建兰（C. ensifolium）、墨兰（C. sinense）、寒兰（C. kanran）、春劍（C. goeringii var. longibracteatum）、莲瓣兰（C. tortisepalum）和豆瓣兰（C. serratum）八大类（陈心启，2011），集中分布在长江流域、西南和东南等地区，其中以西南分布最多，其次为东南地区（曾碧玉等，2005）。目前，种质资源缺乏是影响中国兰产业发展的重要因素之一（陈和明等，2007），利用分子标记技术研究中国兰的遗传多样性和亲缘关系等遗传特征可为中国兰育种及种质资源开发利用提供参考依据。近年来，ISSR（Inter-simple sequence repeat，简单序列重复区间）分子标记技术已被应用于中国兰的遗传多样性（高丽和杨波，2006a）、居群遗传结构（Yao and Yang，2007）和亲缘关系（Qian et al.，2014）分析及杂交后代的杂种真实性鉴定（周丽和胡春根，2016）等研究。因此，优化中国兰ISSR分子标记技术对其辅助育种及亲缘关系和遗传多样性分析等研究均具有重要意义。【前人研究进展】目前，已有研究人员采用单因素试验和均匀设计等方法对春兰、建兰、蕙兰和墨兰等的ISSR-PCR反应体系及扩增程序进行优化。高丽和杨波（2006b）通过单因素试验对DNA模板量、dNTPs浓度、MgCl2浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶添加量、退火温度和循环数进行优化，建立了春兰的ISSR-PCR最佳反应体系，并发现上述因素对扩增效果均具有一定的影响。胡薇等（2007）通过均匀设计对引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和Taq DNA聚合酶添加量进行4因素5水平和4因素3水平优化，建立了建兰的最佳ISSR-PCR反应体系，并筛选出14条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。刘菲等（2011）将单因素试验和正交设计试验相结合对中国兰ISSR-PCR反应体系中的dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度和Taq DNA聚合酶添加量进行优化，结果发现Taq DNA聚合酶添加量对扩增效果影响最明显。王朝雯等（2014）通过单因素试验研究多花兰ISSR-PCR反应体系中的Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶添加量、dNTPs浓度和DNA模板量对扩增效果的影响，结果表明除Mg2+浓度外，其他因素对扩增效果影响均较大。【本研究切入点】迄今，鲜见从DNA提取、反应体系、扩增程序和引物筛选等方面进行系统优化中国兰ISSR-PCR技术的研究报道。【拟解决的关键问题】采用L25（53）正交设计试验和单因素试验对ISSR-PCR反应体系中的DNA模板量、引物浓度和2×Taq Master Mix（PCR预混反应液）及循环数、退火温度等5个因素进行优化，建立中国兰的最佳ISSR-PCR反应体系，并利用最佳反应体系从哥伦比亚大学（UBC）公布的100条ISSR通用引物中筛选出适用于中国兰的ISSR候选引物，为利用ISSR分子标记技术进行中国兰种质资源鉴定、分子辅助育种及亲缘关系和遗传多样性分析等提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 材料与仪器

供试中国兰为墨兰品种企黑、春剑品种边草、寒兰品种应钦素、春兰品种翠一品、蕙兰品种虞山梅和莲瓣兰品种合家欢，种植于福建省林业科技试验中心兰花种质资源圃，均为5年生，分别采集其健康叶片，于-80 ℃保存备用。主要试剂：高效植物基因组DNA提取试剂盒和2×Taq Master Mix（由Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和MgCl2混合而成）购自天根生化科技（北京）有限公司。主要仪器设备：离心机（SIGMA 1-14K）、高通量组织研磨仪（YMY-200）、电泳仪（BIO-RAD PowerPac Universal）、电泳凝胶成像仪（BIO-RAD Gel DOCTMXR+）、超微量核酸测定仪（Thermo NANODROP ONE）、移液器（Eppendorf Research Plus）和PCR仪（BIO-RAD T100TM）等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 DNA提取 对采集的叶片样品分别用两种方式进行破碎研磨：（1）陶瓷研钵研磨法（简称研钵法）：陶瓷研钵用液氮预冷，称取0.5 g叶片样品置于陶瓷研钵中充分研磨至粉末状，取粉末。（2）高通量组织研磨仪钢珠高频振荡破碎法（简称研磨仪法）：研磨仪配套的离心管盒、离心管和钢珠用液氮预冷，称取0.5 g叶片样品置于装有1个钢珠的离心管，盖好盖子，以频率1800次/min进行振荡破碎，时间为3 min，结束后取粉末。

参照高效植物基因组DNA提取试剂盒说明，分别提取两种破碎研磨方式获得的粉末基因组DNA，并用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测（110 V恒压下电泳25.0～30.0 min），用凝胶成像系统拍照。

1. 2. 2 引物设计及合成 本研究所用引物为UBC公布的100条ISSR通用引物，编号为UBC801～ UBC900，由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1. 2. 3 ISSR-PCR反应体系的正交试验 采用L25（53）正交试验设计，以合家欢基因组DNA为模板，对ISSR-PCR反应体系中的引物浓度、DNA模板量和2×Taq Master Mix添加量进行优化，因素和水平设计如表1所示，共25个组合，每个组合设2个重复，均以UBC807为引物。扩增程序：94 ℃预变性4.0 min；94 ℃ 1.0 min，50 ℃ 1.0 min，72 ℃ 1.5 min，进行40个循环；72 ℃延伸8.0 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测（110 V恒压下电泳25.0～30.0 min），凝胶成像系统下成像拍照。

参考尚小红等（2018）的直观分析法进行电泳扩增谱带分析，即根据电泳图谱中电泳条带数量、清晰度、重复性、亮度和背景干净程度分别对25个组合进行打分，1～4分（清晰条带少，亮度弱，杂带多，重复性差，背景模糊），5～8分（清晰条带多，但亮度较弱，有杂带，重复性好，背景较干净），9～12分（清晰条带多，亮度较强，无杂带，重复性好，背景清晰），13～16分（清晰条带多，亮度强，无杂带，重复性好，背景清晰）。利用Excel 2007计算均值（Km）和极差R，确定最佳ISSR-PCR反应体系。

1. 2. 4 退火温度和循环次数优化 以UBC807为引物，利用最佳ISSR-PCR反应体系对扩增程序中的退火温度和循环数进行单因素试验，其中循环数设为30、35、40和45共4个梯度，退火温度使用PCR仪的自动梯度48.0、48.3、48.8、49.6、50.5、51.2、51.7和52.0 ℃共8个梯度，共32个组合。通过电泳图的直观观察，选择条带清晰、重复性好、多态性好、成本低的组合作为最佳组合。

1. 2. 5 引物筛选 利用优化获得的最佳ISSR-PCR反应体系、退火温度和循环数对UBC公布的100条ISSR通用引物进行筛选，筛选出条带清晰，多态性好的引物作为中国兰的ISSR候选引物。为了使筛选结果更具代表性，将企黑、边草、应钦素、翠一品、虞山梅和合家欢的DNA进行同浓度等量混合组成的基因池为模板。

2 结果与分析

2. 1 两种破碎研磨方法对DNA提取效果的影响

由图1可知，研钵法和研磨仪法提取的DNA电泳条带清晰，均具有较好的完整性，但研钵法提取的DNA（图1-A）较研磨仪法（图1-B）存在较明显的降解现象。由表2可知，研磨仪法提取的DNA浓度达167.5～238.7 ng/μL，但研钵法提取的DNA浓度仅为16.3～25.7 ng/μL，即研磨仪法的DNA浓度明显高于研钵法。两种方法提取的DNA OD260/OD280均在1.70～2.00，表明使用这两种方法均可得到质量较好的中国兰叶片DNA。

2. 2 PCR反应体系的正交试验结果

根据电泳结果可知，正交试验25个组合的扩增条带数量、清晰度、亮度和重复性等均存在明显差异，其中合家欢的25个组合扩增产物电泳图如图2所示。利用直观分析法分别对其进行打分，打分结果如表3所示。组合1、6、11和16扩增谱带的多态性较高，但条带模糊；组合10的多态性最低；组合4、5、13、20、24和25的扩增效果较理想。Km表示因素m水平下的均值，Km越大，該水平扩增效果越好；R反映因素对扩增效果的影响程度，R越大，该因素对扩增效果的影响越大（尚小红等，2018），因此可确定3个因素对ISSR-PCR反应体系扩增效果的影响程度排序为DNA模板量>引物浓度>2×Taq Master Mix添加量，最佳组合为DNA模板量50 ng，引物浓度1.0 μmol/L，2×Taq Master Mix添加量10.0 μL。但综合考虑成本，以较少的试剂用量达相似效果即为最佳ISSR-PCR反应体系。在25个组合中，组合4的DNA模板、引物和2×Taq Master Mix用量均较少，扩增效果较佳，因此确定组合4为最佳ISSR-PCR反应体系，即20.0 μL反应体系中含10 ng DNA模板、引物0.8 μmol/L、2×Taq Master Mix 9.0 μL。

2. 3 退火温度和循环数的优化结果

由图3可知，35个循环+48.3 ℃、35个循环+48.8 ℃、35个循环+49.6 ℃、40个循环+48.0 ℃、40个循环+48.3 ℃、40个循环+49.6 ℃、40个循环+50.5 ℃、40个循环+51.2 ℃、45个循环+48.0 ℃、45个循环+51.2 ℃、45个循环+51.7 ℃和45个循环+52.0 ℃共12个组合具有清晰、稳定的扩增谱带。当循环数为30个时，扩增谱带模糊，而循环数为35、40和45个时均可扩增出清晰易辨的谱带。综合扩增时长和谱带质量，最佳的PCR程序循环数为35个，退火温度为48.0～49.6 ℃时，均可获得较好的扩增效果，其中以退火温度为49.6 ℃时最佳。

2. 4 引物筛选结果

以混合的DNA基因池为模板，应用最佳ISSR-PCR反应体系进行PCR扩增，结果如图4所示。从100条ISSR引物中共筛选出44条电泳条带清晰的通用引物，但以具有3条或3条以上清晰条带作为多态性较好的标准，UBC878和UBC853被剔除，剩余的42条引物扩增条带清晰、多态性良好，可作为中国兰的ISSR候选引物，引物序列见表4。优化获得的最佳ISSR-PCR反应体系不仅适用于引物UBC807，同时适用于其他41条ISSR引物。

3 讨论

ISSR分子标记是一种以微卫星序列为引物进行多位点PCR扩增技术。清晰、稳定、多态性好的DNA指纹图谱是ISSR分析的基础，而DNA模板量和质量、引物浓度、DNA聚合酶量、循环数和退火温度等均是影响图谱质量的主要因素，因此，优化DNA提取方法、ISSR-PCR反应体系和扩增程序尤为重要。

高质量的DNA模板是ISSR分子标记的基础。对于中国兰，尤其是名贵中国兰品种，采摘叶片对其植株的生长影响较大，尤其是采摘幼叶，由于叶片组织的纤维较多，质地较硬且粗糙，研磨时常见条状纤维，故破壁效果较差，但采摘花苞对中国兰生长影响小，及时摘除花苞反而能减少营养消耗，且花苞易研磨，因此，花苞是提取中国兰DNA的首选材料（陈惠云等，2005），但受采摘时间限制，且花苞的蛋白质、多糖和酚类物质含量远高于叶片，提取高质量DNA较叶片困难（陈惠云等，2005；李小玲和华智锐，2014）。相对于普通中国兰品种，叶片仍是提取基因组DNA的主要材料，提取率与叶片的幼嫩程度相关，老叶木质化程度较高导致研磨困难，提取率较低，嫩叶易研磨，提取率较高（胡薇等，2004；李小玲和华智锐，2014）。本研究对采集的叶片样品分别用研钵法和研磨仪法进行破碎研磨，比较两种方法提取DNA的效果，结果显示，研磨仪法提取的DNA浓度明显高于研磨法，表明研磨仪研磨可促进叶片的破碎，从而提高DNA提取率。可见，提取中国兰DNA可优先选择研磨仪研磨。

ISSR分子标记是一种基于PCR扩增的遗传分析技术，扩增效果受诸多因素影响，主要有DNA模板量、引物浓度、Taq DNA聚合酶、退火温度和循环数等。高丽和杨波（2006b）研究表明，DNA模板量、dNTPs浓度、MgCl2浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶添加量、退火温度和反应循环数对春兰的ISSR-PCR扩增效果具有不同程度的影响，其中DNA模板量对扩增效率的影响较小，但引物浓度对扩增效率的影响较大。马丽娅等（2008）研究表明，DNA模板量对ISSR-PCR扩增效果的影响不明显。以上研究结果均显示，DNA模板量对扩增效果的影响较小，其原因可能是以上研究均采用单因素试验，研究结果只代表在单一维度下不同因子的影响力。而本研究采用正交试验，从多维度对中国兰的ISSR-PCR反应体系进行优化，结果表明，DNA模板对PCR反应结果的影响最大，其次为引物浓度，2×Taq Master Mix添加量的影响最小。传统的ISSR分析方法需在反应体系中加入Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液等多种试剂（高丽和杨波，2006a；胡薇等，2007；马丽娅等，2008），但本研究使用2×Taq Master Mix，该试剂混合了Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液，即2×Taq Master Mix作为一个整体，与将Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2等试剂单獨作为考察因子的研究存在一定差异，今后应深入研究其差异，以全面系统地优化ISSR-PCR反应体系。

4 结论

研磨仪法可有效提高中国兰基因组DNA的提取率和质量，且利用优化后的ISSR-PCR反应体系和扩增程序及筛选出的引物扩增获得的条带清晰、稳定，多样性好，可用于中国兰的遗传多样性和亲缘关系等分析研究。

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（責任编辑 陈 燕）