孙伟博 马晓星 诸葛强

摘要：【目的】分析预测杨树类甜蛋白（TLP）基因家族功能，为杨树TLP蛋白的差别研究、功能基因发掘及遗传性状改良提供理论依据。【方法】从Phytozome数据库搜索杨树TLP基因家族序列，并依据Pfam数据库进行筛选鉴定，利用生物信息学方法对其编码的蛋白氨基酸序列进行预测分析。【结果】从Phytozome数据库中筛选获得50个TLP基因家族序列，其编码的蛋白分子量10.19～74.09 kD，氨基酸数量98～672个，等电点（pI）4.15～9.12，大部分为亲水性蛋白和不稳定性蛋白，在细胞内外均有分布，并具有thaumatin蛋白家族的保守结构域，其中42个成员能形成与抑菌有关的酸性侧翼区域，且大多数成员具有FF motif结构和5个保守的REDDD氨基酸残基，但少数氨基酸残基发生改变。50个杨树TLP基因家族成员可分为4个进化组，各进化组成员的蛋白理化特性和亚细胞定位不完全一致，且功能域结构和motif结构也具有多样性，各进化组成员间差异与进化程度总体上呈正相关。根据motif结构和功能域结构可将所有成员分别分为7组和4组，但分组结果与系统发育进化结果并不完全一致。【结论】杨树TLP蛋白家族成员存在序列保守性和进化性，特异表达呈多样性，具有抗菌活性，但作用机制存在差异。

关键词： 杨树；类甜蛋白（TLP）；生物信息学；系统发育进化；结构域；功能预测

中图分类号： S792.11 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1265-08

0 引言

【研究意义】类甜蛋白（Thaumatin-like protein，TLP）属于病原相关蛋白（Pathogenesis-related proteins，PRs）的一种，广泛分布在植物、动物和真菌中，由病原体或其他外界因子诱导表达（van Loon et al.，2006；Shatters et al.，2006；Liu et al.，2010；Masaki et al.，2014；Franco et al.，2015）。根据序列相似性、理化特性及蛋白功能差异，PRs可分为17个家族，即PR-1～PR-17（Shatters et al.，2006）。TLP属于PR-5家族，该家族成员具有多肽结合活性、β-1，3葡聚糖酶活性、抗真菌、调节渗透势及抑制酶活性等多种生物学功能（Liu et al.，2010）。因此，通过生物信息学方法对杨树TLPs基因家族进行研究，揭示其编码蛋白的特性、进化关系及结构信息，并对所有成员进行相关分类及功能预测，可为深入分析成员间的功能差异、表达途径中的应答调控网络和互作因子提供参考，对杨树功能基因的发掘及遗传性状改良具有重要意义。【前人研究进展】根据TAIR数据库和Phytozome数据库，植物TLP基因多以基因家族形式出现，如拟南芥有25个TLP基因，而杨树有50个TLP基因（Ulm et al.，2002）。TLPs基因家族起源于单子叶植物和双子叶植物分化前的古老序列，在进化过程中由于基因突变和染色体复制而形成复杂的基因家族（Brites et al.，2013）。TLP具有广谱的抗菌活性和酶抑制活性，在植物体内主要为诱导性表达，如花旗松被真菌感染后，其根部TLP基因表达水平显著提高，从而抑制真菌生长（Zamani et al.，2004）；水稻被白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）侵染后，施用苯并噻二唑可导致TLP基因被诱导富集表达，从而提高植株对病原菌的抗性（Mohan et al.，2015）；蒜被镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cepae）侵染、茉莉酸甲酯和乙烯等化学物质处理及物理伤害时，茎中TLP基因表达水平均明显提高，以增强植株对真菌和逆境协迫的抗性（Rout et al.，2016）；杨树TLP基因为组成型表达（Dafoe et al.，2010），表明其均与植物抗病能力有关。但也有研究表明，具有相同结构和理化特性的TLP并不都具有抗菌能力，如通过伤害番木瓜树组织，从伤口处的胶乳中提取到TLP（22 kD），其无法抑制真菌生长（Looze et al.，2009）；在香蕉、苹果和樱桃果实中也存在TLP不能抑制真菌生长的现象（Barre et al.，2000；Menu-Bouaouiche et al.，2003）。竹笋TLP虽然不具备典型的TLP蛋白家族成员特征，却能有效抑制尖孢镰孢霉（F. oxysporum）、落花生球腔菌（Mycosphaerella arachidicola）和灰霉菌（Botrytis cinerea）的菌丝体生长（Wang et al.，2011）。可见，目前TLP的分子结构和抗菌作用机理尚不清楚。此外，在盐碱、干旱和低温等胁迫处理下，TLP能提高冬黑麦、烟草、杜梨和冬蔓菁等植物的抗性（Griffith et al.，2005；Li et al.，2014；Wang et al.，2014；Ma et al.，2017），表明TLP在生物和非生物胁迫等多信号途径中发挥作用，但相关作用机制尚无报道。【本研究切入点】目前，针对TLP的研究主要集中于草本植物，有关木本植物的研究鲜见报道，尤其是利用生物信息学方法对杨树TLP的基因数目、功能域结构等方面的研究尚无报道。【拟解決的关键问题】从Phytozome数据库搜索杨树TLPs基因家族序列信息，利用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构组成、功能域等进行预测分析，为杨树TLP蛋白的功能差异研究、功能基因发掘及遗传性状改良提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 数据来源

根据已发表的其他物种TLP基因序列，利用生物信息学方法从Phytozome数据库（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）搜索杨树TLPs基因家族序列，并依据Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）中thaumatin结构域（ID：PF00314）的定义对搜索获得的序列进行筛选及鉴定，最终确定杨树TLP基因序列。

1. 2 理化特性分析及亚细胞定位

利用在线生物信息学工具Expasy Protoparam和Wolf PSORT对杨树TLP基因的编码蛋白进行理化性质预测及亚细胞定位。

1. 3 系统发育进化分析

使用ClustalX 2.1将筛选获得的杨树TLP蛋白氨基酸序列进行比对（参数默认），并利用Mega 7.0进行Neighbor-Jioning聚类分析，自展检测Bootstrap值设为1000。

1. 4 结构分析及功能预测

利用MEME Suite对TLP蛋白motif信息进行分析，将预测结果数目设为5，最小氨基酸数目设为6，最大氨基酸数目设为50；利用HMM在线工具及String、KEGG、MINT等相关蛋白数据库信息对其跨膜结构、信号肽和功能结构域进行预测分析；通过SWISS-MODEL进行蛋白质三级结构预测，参照模板数量为50个，并通过PDB-viewer对三级结构模型进行观察分析。

2 结果与分析

2. 1 杨树TLP蛋白的理化性质

从Phytozome数据库共筛选出50个杨树TLP基因序列，其编码蛋白的理化性质如图1所示。杨树TLP蛋白的分子量10.19～74.09 kD，氨基酸数量98～672个，等电点（pI）4.15～9.12，其中酸性蛋白占68%；亲水性指数（GRAVY）-0.262～0.181，66%的TLP蛋白为亲水性蛋白；所有蛋白的脂溶指数（Aliphatic index）较高，为38.79～87.20，均为脂溶性蛋白；不稳定指数（Instablity index）为22.81～72.64，64%的TLP蛋白具有不稳定性。可见，杨树TLP蛋白家族不同成员间理化性质存在明显差异。由此推测，这些蛋白质的酸碱性质和亲水性对其在不同环境中的稳定性、抗菌谱和抗菌活性均影响，而小分子量的蛋白更有可能在信号转导途径中发挥作用（Mccarthy et al.，2011）。

2. 2 杨树TLP蛋白的亚细胞定位结果

亚细胞定位结果（图1）显示，杨树TLP蛋白在细胞内外均有分布，其中定位于叶绿体上的成员数量最多，占蛋白总数的46%，其次是定位于细胞外的蛋白数量，占蛋白总数的26%，剩余成员则分别定位于细胞膜、高尔基体、液泡、过氧化物酶体、细胞核和溶酶体，表明杨树TLP蛋白特异表达具有多样性。由于蛋白表达位置与其功能具有密切关系，定位不同的蛋白在生物学进程中发挥的作用也不同（柴秋霞，2014），因此，推测亚细胞定位不同的TLP蛋白家族成员在生物学功能或作用机制方面存在差异。

2. 3 系统发育进化树分析结果

系统发育进化树如图1所示，50个杨树TLP蛋白家族成员可分为4个进化组，其中，进化组1和进化组3各有12个成员，进化组4有20个成员，进化组2有6个成员。各进化组成员蛋白的理化特性和亚细胞定位并不完全一致，且功能域结构和motif结构也呈多样性，但各进化组成员间差异与进化程度总体上呈正相关，表明杨树TLP基因家族在进化中不断分化。

利用Phytozome数据库的exHeatmap在线工具绘制38个TLP基因成员的功能热图，如图2所示。38个杨树TLP基因成员可分为4组，具有功能相近的成员分在同一组，与系统发育进化树分组数目相一致，但功能相近的成员也并不完全分在同一进化组。可见，二者的分析结果存在一定差异性，一方面反映出杨树TLP蛋白的结构和生物学功能具有多样性，另一方面，结合其蛋白理化特性和亚细胞定位结果，反映出该家族成员的表达模式也具有多样性。

杨树TLP蛋白氨基酸序列比对结果如图3所示。不同TLP蛋白家族成员间保守的酸性氨基酸位点存在明显差异，但其中有42个成员能形成与抑菌有关的酸性侧翼区域，每个侧翼均由一段超过20个氨基酸残基的长序列和一段低于10个残基的短序列构成，且序列内包含多个疏水性和亲水性的保守氨基酸位点，其他8个成员无抑菌结构。大多数成员具有FF motif结构和5个保守的REDDD氨基酸残基。虽然FF motif结构高度保守，但仍有TLP蛋白家族成员的少数氨基酸残基发生了改变，如FF motif的第111位点保守氨基酸应为苯丙氨酸（F），但有15个成员的此位点发生改变，其中有5个成员的此位点替换为较保守的酪氨酸（Y），有7个成员的此位点突变为与苯丙氨酸同样具有疏水性的異亮氨酸（I）或甲硫氨酸（M）等，还有3个成员的此位点发生缺失；FF motif的第119位氨基酸也发生改变，与第111位点相比，发生改变的成员数目减少，且大部分替换为较保守的酪氨酸，仅有2个成员（Potri.009G028800和Potri.001G237600）序列的此位点突变为亲水性丝氨酸（S）。在REDDD结构中也存在保守位点氨基酸改变现象，可能是造成成员间功能差异的原因之一。所有杨树TLP蛋白家族成员芳香族的亮氨酸（L）和半胱氨酸（C）均保持高度保守，推测其疏水性对抗真菌活性或其他功能具有重要影响。

2. 4 杨树TLP蛋白结构分析及功能预测结果

根据蛋白氨基酸序列比对结果，对筛选获得的杨树TLP蛋白进行三级结构建模，结果如图4所示。杨树TLP蛋白中均存在5个motif结构（motif 1～motif 5），其中motif 3、motif 4和motif 5构成完整裂缝结构的侧翼，motif 3和motif 4为基本构成元件；全部成员中仅Potri.002G133200.1和Potri.001G221600.1无明显的裂缝结构，且Potri.002G133200.1缺少基本构成原件motif 4。

通过PDB-viewer对三级结构模型进行观察分析，发现并非所有的TLP蛋白功能域中均存在5个motif，如Potri.011G004000.1的motif 3和motif 4构成功能裂缝的一侧，但并不位于功能结构域，同时该蛋白还缺少motif 2和motif 5。由于裂缝结构与蛋白的功能密切相关，在抑菌蛋白中裂缝结构是表征抗菌活性的重要结构，因此，根据motif结构特征可将杨树TLP蛋白家族成员分为7组，各组成员具有代表性的三级结构模型如图4所示，该分组结果与系统发育进化分类结果存在一定差异，具体原因有待进一步探究。

利用MEME Suite对TLP蛋白motif信息进行分析，其保守motif相关分布情况如图1所示。有41个成员具有相同的保守motif序列分布，且具有完整的5个结构原件；其余9个成员中，Potri.T094200.1、Potri.001G222000.1和Potri.001G221300.1均缺少motif 1和motif 5，Potri.011G004000.1、Potri.002G133

200.1和Potri.001G221600.1各缺少2個不同的motif，其他成员均缺少一个motif，其中Potri.004G014200.1缺少motif 1，Potri.T091300.1和Potri.001G107700.1缺少motif 5。在所有motif当中motif 3的保守性最高，在全部成员中均存在。

根据String数据库信息可知，杨树TLP蛋白与大豆和葡萄TLP蛋白序列亲缘关系最近，尽管大豆和葡萄中TLP蛋白注释为抑菌相关，但无杨树TLP蛋白的功能注释。KEGG数据库对PR家族部分蛋白在抑菌和抗胁迫的功能进行了注释，但对杨树50个TLP蛋白均未注释，表明杨树TLP蛋白家族功能尚不明确或未收录。50个杨树TLP蛋白在MINT数据库也无检索结果。

为了获取有关杨树TLP蛋白的功能信息，本研究对更多的数据库进行搜索，结果显示，在Refe-rence proteoms数据库中70%杨树TLP蛋白的近缘蛋白被注释为α-N端氨基转移酶（Alpha N-terminal protein methyltransferase 1），仅Potri.001G221300.1的近缘蛋白注释为TLP家族蛋白成员，Potri.009G028

800.1和Potri.001G237600.1被注释为类渗透蛋白家族成员（Osmotin-like family protein），其余成员的近缘蛋白被注释为未定义蛋白；在UniProtKB数据库中仅Potri.001G221300.1的近缘蛋白注释为甲基化酶（Methylase involved in ubiquinone/menaquinone biosynthesis），其余成员的近缘蛋白被注释为未定义蛋白。虽然在不同的数据库中有关杨树TLP近缘蛋白的功能注释搜索结果存在明显差异，且近缘蛋白来自不同物种，但利用Pfam数据库对其结构进行分析，发现50个杨树TLP蛋白家族成员在上述数据库中均显示具有thaumatin结构域。因此，根据蛋白thaumatin结构域前后序列中是否存在信号肽和跨膜区域（图1），可将杨树TLP蛋白分为四大类，第Ⅰ类具有信号肽和跨膜区域；第Ⅱ类仅具有信号肽；第Ⅲ类仅具有跨膜区域；第Ⅳ类均无信号肽和跨膜区域。将该分类结果与系统发育进化树相比，发现具有相同结构特征的蛋白属于不同进化组，表明TLP蛋白家族成员在进化过程中具有较强的功能选择性。

3 讨论

本研究发现，50个杨树TLP基因成员可分为4个进化组，与根据蛋白thaumatin结构域前后信号肽和跨膜区域的分组结果不一致，与根据功能热图和motif结构特征的分组结果也不一致，表明杨树TLP蛋白在进化过程中具有丰富的多样性，与水稻和拟南芥中TLP蛋白家族的研究结果（Liu et al.，2010）一致，且通过结构分析也发现TLP蛋白家族在杨树中既高度保守又存在多样性，如进化组2中的成员均具有蛋白激酶结构域，与拟南芥中TLP-K具有高度相似性（Chae et al.，2009），推测进化组2的成员可能发挥信号因子的作用。此外，本研究发现，4个进化组中共有8个成员无抑菌结构，可能是高度保守中的积极进化，有助于TLP进化出新的生物学功能（Luchakivska et al.，2015）。本研究蛋白质亚细胞定位结果表明，杨树TLP蛋白在细胞内外均有表达，推测杨树TLP蛋白参与多个器官功能进程（Alisoltani et al.，2015）。本研究还发现，杨树TLP蛋白家族成员的motif和功能域具有多样性，表明该蛋白家族在进化过程中发生了较多可变剪切，且在是否存在信号肽和跨膜区域方面也存在明显差别，说明各成员在参与应对外界胁迫中发挥不同作用，与绿豆TLP蛋白家族的研究结果（Liu et al.，2017）一致。Liu等（2017）研究发现，绿豆TLPs基因家族中共存在4种基因型，且内含子差异形成了多样的基因结构类型，同时90%以上的成员参与胞外作用和多器官发育进程，表明TLP蛋白在植株生长发育和抵抗胁迫过程中发挥重要作用。

前人研究表明，杨树TLP蛋白中保守酸性氨基酸残基及酸性侧翼均属于消极进化，虽然不同成员在保守位点存在差异，但酸性结构区如保守的疏水性和亲水性氨基酸对TLP蛋白功能稳定性尤其是抗真菌活性发挥重要作用（李文娴等，2010），该结论在本研究中得到进一步认证。尽管TLP蛋白的积极进化可能是蛋白自身适应环境变化而产生的被动进化，但根据其保守性推测其主要功能仍具抗真菌活性（Liu et al.，2010）。目前，TLP蛋白已广泛用于作物的抗真菌改造研究，如将拟南芥TLP基因转入胡萝卜后，胡萝卜植株对灰霉菌（Botrytis cinerea）和核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的抗性较强（Punja et al.，2016）；在木薯中过量表达水稻TLP基因能提高其对胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的抗性（Ojola et al.，2018）。还有研究表明，TLP蛋白在植物抗寒过程中发挥重要作用（Marangon et al.，2011）。由此推测，杨树TLPs基因家族成员在结构和进化关系上具有丰富多样性，具有向功能多样性进化的潜力。尽管如此，系统发育分析和功能预测的结果尚不能完全作为TLP生物功能判定的依据。因此，在今后的抗病育种工作中，应综合考虑基因家族的多样性与保守性，根据亚家族组内一致性和组间差异性进行功能基因挖掘。

4 結论

杨树TLP蛋白家族成员存在序列保守性和进化性，特异表达呈多样性，具有抗菌活性，但作用机制存在差异。

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（責任编辑 陈 燕）