付任胜+管长志+尹立荣+陈磊+段红英+刘俊环

摘    要：利用已发表的区分胡萝卜育性的标记引物对胡萝卜线粒体DNA进行PCR扩增，开展育性鉴定研究。结果表明，所用的2对标记引物都能用于区分一种遗传背景的材料组合，并可用于品种纯度鉴定，而另一种材料组合不能区分。

关键词：胡萝卜;线粒体;PCR;分子标记;育性

中图分类号：S631.2                文献标识码：A               DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.002

Deferential Carrot Sterility and Fertility by PCR Molecular Marker

FU Ren-sheng1，GUAN Chang-zhi1，YIN Li-rong1，CHEN Lei1，DUAN Hong-ying2，LIU Jun-huan3

（1.Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology， Tianjin 300384， China; 2.Tianjin Xiqing Plant Protection Station，Tianjin 300381， China; 3.Tianjin Wuqing Plant Protection Station， Tianjin 301700， China）

Abstract： Cytoplasmic male sterility usability is important for carrot F1 hybrid development .Carrot mitochondrion DNA was isolated and PCR amplified by published primers. The results showed that two pairs of marker primers could be utilized to deferential one material combination and identify variety purity， not able to deferential another material combination.

Key words： Daucus carota;mitochondria;PCR;molecular marker;sterility and fertility

植物细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility， CMS ） 是人类能够高效利用植物生产的一类重要性状，雄性不育性状的鉴定通常是在植物开花时观察鉴定[1-4]，分子生物学的发展为细胞质雄性不育研究提供了新的有效手段，其优点在于在植物生长发育的任何阶段，只需提取适当的DNA即可鉴定。胡萝卜CMS的发现应用对人类培育胡萝卜F1杂交品种具有决定性的作用，开展胡萝卜CMS分子水平的研究具有重要意义，国内学者在分子水平上开展了胡萝卜CMS相关工作，如于春霞、梁毅等对瓣化型胡萝卜胞质雄性不育系和保持系进行了cDNA-AFLP分析，筛选与不育性相关的特异片段[5-6]，但仅限于少量的试验材料，未见报道加以应用。国外学者对胡萝卜细胞质雄性不育分子水平开展了研究，结果认为细胞质雄性不育与线粒体有关[7-9]，并获得线粒体上与雄性不育有关的DNA标记，采用基于PCR的SSR标记区分胡萝卜“瓣化型”雄性不育植株和可育植株[10]，并在多个胡萝卜不同根型的线粒体上进行区分验证，能较好地区分。本研究选取已发表的标记引物，对课题组拥有的胡萝卜材料进行育性鉴定研究，以期拓展现有标记应用范围，为进一步筛选稳定、可靠的胡萝卜CMS的标记奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

胡萝卜Sk4为瓣化型CMS，HY 为可育。Sk4×HYF1为Sk4与HY杂交种，瓣化型CMS，HYEH为瓣化型CMS。HYEH×HYF1为HYEH与HY杂交种，瓣化型CMS。

1.2 方 法

1.2.1 胡萝卜线粒体DNA的提取 胡萝卜种子分别播种于口径30 cm，高度25 cm的塑料盆中，待胡萝卜苗长至6～8片叶时，进行遮光处理1周，以减少淀粉因素的干扰，剪取黄化幼嫩叶片，采用从上海杰美基因医药科技有限公司购买的线粒体DNA提取试剂盒，鉴于胡萝卜是多糖和多酚类型材料，提取过程中增加了二硫苏糖醇（DDT）、十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）。对最终提取获得的胡萝卜线粒体DNA提取物，在1%琼脂糖凝胶上进行了电泳，予以验证。电压100 V，电泳时间30 min，将染色凝胶在成像系统下拍照。

根据已发表文献确定2对引物，如表1。

1.2.2 PCR扩增 PCR 反应体系：反应总体积为20 μL，包括模板DNA 20～60 ng，Taq DNA 聚合酶0.5 U，dNTPs（each 0.1 mmol·L-1），1.5 mmol·L-1 MgCl2，引物0.4 μmol·L-1。将所有反应物混匀后，于PCR 仪上扩增（MJ PTC-200）。PCR反应条件：预变性95 ℃ 2 min，变性95 ℃ 1 min，引物退火55 ℃1 min，72 ℃引物延伸2 min 30 s;72 ℃延伸7 min。PCR 产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。取PCR 产物6 μL 与1 μL loading dye 混合后上样，在电压为80 V 条件下电泳25 min，电泳结束后，将染色凝胶置于成像系统中观察并照相。

2 结果与分析

2.1 胡萝卜线粒体DNA的提取

泳道Ma为碱基5 000 bpMarker，1为胡萝卜Sk4×HYF1，2为Sk4，3为HYEH×HYF1，4为HY，5为HYEH。从图1可以看出，泳道1、2、3、4、5都有一条明显条带，表明成功提取了线粒体DNA，泳道3条带相对较浅，应是线粒体DNA浓度较低。

2.2 引物1扩增片段

利用引物1对Sk4×HYF1，Sk4，HYEH×HYF1，HY，HYEH进行PCR扩增。从图2可以看出，泳道3（ HYEH×HYF1），5（HYEH）都出现了1条相同的扩增条带，与Inga C.Bach等人研究结果比较，条带的碱基大小应为1 100 bp，而其他泳道未出现扩增条带。1（Sk4×HYF1）和2（Sk4）都为雄性不育系，也未扩增出条带，试验结果表明该引物不能对全部不育系都扩增出条带。

2.3 引物2扩增片段

利用引物2对Sk4×HYF1，Sk4，HYEH×HYF1，HY，HYEH进行PCR扩增。从图3可以看出，泳道1（Sk4×HYF1），3（ HYEH×HYF1），5（HYEH）都出现了1条相同的扩增条带，与Inga C.Bach等人研究结果比较，条带碱基大小应为321 bp，而Sk4为雄性不育系，未扩增出条带，本试验表明该引物也不能对全部不育系都扩增出条带。泳道4（HY）有1条扩增条带，比泳道1（Sk4×HYF1），3（ HYEH×HYF1），5（HYEH）的条带略大，与Inga C.Bach等人研究结果比较，条带碱基大小应为392 bp。

3 结论与讨论

利用2对引物对Sk4×HYF1和Sk4扩增，都未能全部扩增出可以区分胡萝卜材料雄性不育和可育的标记片断。而Inga C.Bach等人研究结果为利用这2对引物都能区分试验全部的雄性不育和可育材料，所用的材料属于Imperator， Nantes， Imperator-Nantes， Danvers-Chantenay。而本试验的Sk4为Imperator-Kuroda，存在这种差异可能源于不同核基因组背景导致的线粒体基因组的重排或缺失和线粒体基因组动态特性。这也表明期望1至2个标记区分所有不同遗传背景的胡萝卜雄性不育和可育材料是不可靠的。因而，开发更多的标记区分胡萝雄性不育和可育就显得非常必要。

HYEH和HY分别是商业种 HYEH×HYF1的雄性不育母本和雄性可育父本，在该试验中，利用PCR扩增，根据条带的碱基大小区分胡萝卜雄性不育和可育，利用这一结果，2对引物都可用于商业种HYEH×HYF1生产制种的纯度检测，防止混杂有父本种子。

参考文献：

[1] STRUCKMEYER E， SIMON P. Anatomy of fertile and male-sterile carrot flowers from different genetic sources[J]. Amer Soc Hart Sci，1986， 111：965-968.

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[5] 于春霞 ，梁毅，李景富.瓣化型胡萝卜胞质雄性不育相关片段 的分离及序列分析[J].农业生物技术科学，2006 ，22 （1）：16-20.

[6] 于春霞 ，梁毅，李龙年. 瓣化型胡萝卜胞质雄性不育基因atp的CAPS标记建立[J].中国农学通报，2007，23（2）：68-72.

[7] NAKAJIMA Y， YAMAMOTO T， MURANAKA T， et al. A novel orfB- related gene of carrot mitochondrial genomes that is associated with homeotic cytoplasmic male sterility （CMS） [J]. Plant Mol Biol，2001，46：99-107.

[8] NAKAJIMA Y， OEDAK， YAMAMOTO T. Characterization of genetic diversity of nuclear and mitochondrial genomes in Daucus varieties by RAPD and AFLP[J]. Plant Cell Rep，1998，17：848-853.

[9] NAKAJIMA Y， YAMAMOTO T， MURANAKA T， et al. Genetic variation of petaloid male-sterile cytoplasm of carrots revealed by sequence-tagged sites（STSs） [J].Theor Appl Genet，1999，99：837-843.

[10] BACH I C，OIESEN A，SIMON P W. PCR-based markers to differentiate the mitochondrial genomes of petaloid and male fertile carrot （Daucus carota L.） [J].Euphytica ，2002，127（3）：353-365.