张培海，李广森△，常德贵，蔡 剑，曲晓伟，黄晓朋，陈帝昂，尤耀东，俞旭君，张 磊

(1.成都中医药大学附属医院,成都 610072；2.河南省人民医院,郑州 450003； 3.成都中医药大学,成都 610075；4.成都中医药大学第二附属医院,成都 610041)

近年来，受环境污染、心理压力过大、生活方式改变等因素的影响，男性不育的发病率显著上升，在过去几十年间，我国年轻男性精液质量有明显下降趋势[1]。有研究显示，男性因素在我国不孕不育育龄人群中占到50%[2]，据统计主要原因为弱精子症[3]。因为弱精子症的病因和发病机制尚不清楚，所以临床缺乏有效的治疗措施，对于中医药治疗男性不育的效果研究由来已久，且取得了较好疗效[4]。强精片(原名增精1号)经课题研究小组多年临床经验总结研制而来，以补肾填精、益气养血、化瘀利湿为治疗原则。临床随机对照试验研究结果显示效果满意[5]。前期研究发现，该药对大鼠附睾功能性指标具有显著改善和调节作用[6-7]，同时能通过降低睾丸内FasL凋亡因子表达，提高大鼠生殖功能[8]。本研究拟通过观察强精片对弱精子症SD大鼠精子鞭毛结构蛋白表达量的影响，就其作用机理作进一步探索。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠100只，体质量200～230 g，成都达硕动物实验有限公司提供，均自由采食、饮水，饲养于室温20～30 ℃，12 h光、12 h暗的条件下驯养1周后使用。

1.1.2 实验药物 强精片，成都中医药大学附属医院提供(规格0.35 g/片，100片/瓶，批号000613)。用时将强精片研末溶于1%的羧甲基纤维素钠溶液(CMC-Na)，分别配制成相应浓度的混悬液备用。奥硝唑用1%的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制。

1.1.3 主要试剂和仪器 Rat TUBB ELISA kit(批号Rr1068X)L；TCTE3抗体，兔多克隆抗体(批号ab139825)；MDHC7抗体，山羊抗体(批号SC-102481)；生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(批号ab6721)；辣根酶标记链霉素卵蛋白素(HRP/A-V)(批号13152A11)；垂直电泳槽、DYY-6C电泳仪、化学发光凝胶成像仪等(美国Bio-RAD公司)；Thermo全功能酶标仪(型号MK3，美国ThermoFisher仪器有限公司)；WLJY-9000型精子质量检测系统。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 将100只大鼠按体质量分层后随机分为空白组、模型组、强精片高剂量组(高剂量组)、强精片中剂量组(中剂量组)、强精片低剂量组(低剂量组)5组各20只。弱精子症动物模型参照熊芬等[3]方法制作，各实验组分别给予奥硝唑(ORN)200 mg/(kg·d)灌胃，空白组给予等量1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液灌胃。空白组1%羧甲基纤维素钠溶液1 ml/100 g，模型组200 mg/(kg·d) ORN，高剂量组6700 mg/(kg·d)强精片+200 mg/(kg·d)ORN，中剂量组3300 mg/(kg·d)强精片+200 mg/(kg·d)ORN，低剂量组1700 mg/(kg·d)强精片+200 mg/(kg·d)ORN。中药各组在灌胃ORN混悬液前给予不同浓度的强精片混悬液，每周给药6 d，每天1次，连续20 d。大鼠每日称重1次，根据变化调整给药剂量。

1.2.2 标本取材 于末次给药24 h后，用25%氨基甲酸乙酯(4 ml/kg)腹腔注射麻醉后，剪开右侧股动脉采血，后快速打开腹腔剥离大鼠睾丸与附睾。

1.2.3 指标检测

(1)精液分析：称右侧附睾质量置于水浴箱中预温的Hams'F10培养液中剪碎，37 ℃温育30 min，待附睾精子充分游离后搅拌均匀，取1滴于精子计数板上检测精子数量和精子活力。

(2)Western印迹法检测MDHC7、TCTE3表达：取液氮冻存的纯化精子放置在冰上溶解，加入灭菌PBS(pH7.4) 洗涤3次，3000×g离心5 min弃上清。加入30 μL RIPA裂解液(临用前按100∶1比例加入蛋白酶抑制剂PMSF)每10 min涡旋混匀1次，冰上裂解。30 min后将充分裂解的精子4 ℃ 12000 ×g离心10 min，上清即为精子蛋白。BCA法测定蛋白浓度，蛋白等量上样，10%SDS-PAGE 凝胶电泳，200 mA 100 min转膜，用5%BSA(TBST配制，0.05 g/ml)室温摇床封闭1 h，加入兔抗MDHC7抗体(1∶200)、TCTE3 抗体(1∶200)和β-actin(1∶5000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入1∶5000稀释的羊抗兔IgG-HRP孵育1.5 h，TBST洗涤3次，暗室曝光，上机扫描，以β-actin为内参照，用凝胶图像分析成像系统进行扫描分析，结果以目的蛋白相对表达量表示。

(3)ELISA法检测血清TUBB表达：ELISA法测定血清中TUBB含量，测定前盒内所有试剂均恢复至室温，检测TUBB，以试剂盒所示的标准品原始浓度建立标准曲线，然后在酶标仪450 nm波长下测得各标本吸光度值，标准曲线相比得到对应浓度，再乘以相应的稀释浓度，即为TUBB实际浓度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 附睾精子参数

表1显示，与空白组比较模型组a、b、c级精子差异有统计学意义(P<0.01)，各组精子密度差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组a、b、c级精子差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。

表1 各组大鼠附睾精子参数比较[例(%)]

注：与空白组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01

2.2 对MDHC7、TCTE3、TUBB表达的影响

图1表2显示，与空白组比较，模型组MDHC7、TCTE3、TUBB表达差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，高剂量组MDHC7、TUBB表达差异有统计学意义(P<0.05)，其余差异无统计学意义(P>0.05)。随着强精片剂量增加，睾丸中MDHC7、TCTE3、血清TUBB表达量逐渐增加，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠MDHC7、TCTE3、TUBB表达比较

注：与空白组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05

图1 Western印迹检测大鼠睾丸组织中MDHC7、TCTE3蛋白表达比较

3 讨论

男性不育是男科的常见病、多发病，由男性因素所致不育在不孕不育夫妇中约占55.73%[9]。精子活力是衡量精液质量和男性生育能力的重要标志，弱精子症是其中的常见类型。男性不育患者中超过19%存在弱精子症，是导致男性不育的重要因素之一[10]。

中医药在弱精子症的治疗中具有重要作用[11]，多从肾虚、肝郁、气虚、血虚、痰湿、血瘀等方面论治[12]。根据课题小组的临床研究，认为肾虚、血瘀、湿热为主要病机，确立了补肾填精、益气养血、化瘀利湿的治疗原则，研制出院内制剂强精片。前期研究[5]和多方面数据证实，其具有改善精子密度、活力、形态的作用，主要通过增加附睾液SA含量、降低精子膜GPC含量提高睾丸附睾器官系数，促进损伤附睾上皮恢复和上皮细胞的分泌来改善附睾精子成熟功能，提高精子质量；另可通过调节大鼠细胞凋亡通路Fas/FasL提高生育力[6-8]。

精子细胞通过复杂的信息传导、能量物质代谢过程，最终在轴丝复合体的基础上，将化学能转化为机械能。奥硝唑主要作用于垂体性腺轴低端，改变附睾组织功能，影响精子变态末期和成熟期导致精子活动能力下降，停药后精子活力可逐渐恢复正常。本研究中模型组精液密度未见明显降低，a、b级精子比例降低，与文献报道一致[13-14]。弱精子症是由多种原因造成的临床综合征，表现为精子运动能力不足，其中精子结构缺陷尤其是精子尾部结构改变尤为突出。精子尾部结构改变通常包括轴丝异常和轴丝周围结构异常，造成异常最重要的原因就是精子鞭毛结构相关蛋白异常。深入研究与弱精子症相关的特异或非特异蛋白，将为其发病机制提供新的线索和标志。因此，改善精子鞭毛轴丝蛋白表达能促进鞭毛运动，从而提高精子活力是治疗弱精子症的一个有效途径。

微管蛋白(TUBB)是纺锤体的主要组成元件，是纤毛和鞭毛等细胞器官，与细胞的运动、分裂、物质运输等功能密切相关。正常精子在电镜下可观察到尾部具有特点的“9+2”微管结构，微管蛋白降低或断裂可能会导致物质运输障碍，使精子寿命缩短[15]。奥硝唑会导致小鼠精子尾部微管蛋白排列混乱[11]，本研究中随强精片用量增加，血清TUBB浓度增加，强精片可能减少奥硝唑对精子形成过程中精子尾部支撑骨架形成的影响。

大鼠动力蛋白重链7(MDHC7)是人类动力蛋白重链7(HDHC7)同源蛋白，也称轴丝动力蛋白重链1(DNAH1)，该基因缺失可导致精子直线和前向运动能力降低。敲除大鼠MDHC7基因后，发现大鼠精子运动路径速度均降低，鞭毛拍击振幅下降，同时电镜下可见轴丝 C-末端动力蛋白臂缺失[13]。本研究中，随着强精片剂量增加，睾丸MDHC7表达量逐渐增加，高剂量组显著高于模型组，表明使用高剂量强精片改善精子活力可能与MDHC7表达量增加有关。

T复合体相关睾丸表达3(TCTE3)又名 tctex2，是 tctex 家族成员之一 (该家族包括 tctex、tctex1&1 L、tctex2&2β、tctex5)，由 198 个氨基酸组成，大小为 23 ku，是精子鞭毛中段轴丝一种外侧臂轻链蛋白，表达于精子尾部鞭毛中段轴丝的外侧双联微管[16]。TCTE3表达量低是应发原发性纤毛不动症的重要原因[17]。Rashid等[18]敲除大鼠TCTE3后发现，精子出现畸形、运动不协调现象。研究发现，特发性弱精子症患者精子中TCTE3 mRNA和蛋白表达明显下降[14]。TCTE3 表达降低可能会引起精子鞭毛轴丝双联微管内侧轻链缺失，致使精子活力低下，最终导致不育症的发生。

综上，强精片治疗弱精子症疗效肯定，初步机理研究显示其能有效改善附睾、精子膜功能，从而改善精子质量。因此，以精子鞭毛动力蛋白作为切入点，通过测定弱精子症大鼠T复合体相关睾丸表达3(T.Complex associated testis expressed 3，TCTE3)、轴丝动力蛋白重链7(mouse dynein heavy chain 7，MDHC7)、微管蛋白(tubulin，TUBB)在强精片干预前后的表达水平，了解强精片对精子鞭毛动力蛋白合成的作用，进一步探究该药物治疗男性不育的作用机理。本实验结果显示，与模型组比较，随着强精片剂量增加，a、b、c级精子比例显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，高剂量组MDHC7、TUBB表达差异有统计学意义(P<0.05)，血清TUBB表达量逐渐增加，但差异无统计学意义(P>0.05)，提示下一步研究应进一步提高用药剂量且验证效果。

本研究表明，强精片改善弱精子症模型大鼠精子活力效果随药物剂量增加而逐渐增强，并可能通过增加精子尾部鞭毛结构蛋白TUBB、DMHC7、TCTE3的表达，从而提高精子活力，其具体机制尚有待于进一步的研究。