包红桃，王 婷，武权生

(1.兰州市第一人民医院,兰州 730050；2.临洮县中医院,甘肃 定西 730500；3.甘肃中医药大学，兰州 730000)

无排卵性功血是因调节生殖的下丘脑-垂体-卵巢轴神经内分泌紊乱而出现的临床妇科常见病，患者往往会有贫血、感染、不孕等，甚至对妇女的身心健康、生活质量造成很大的影响，还为患者带来严重的经济负担[1-2]。此外，子宫内膜增生过厚在一定条件下还有转变为子宫内膜癌的风险，后期病情严重时甚则会引发失血性休克。目前，西医治疗以药物(激素药和促排卵药)和手术为主，其治疗效果、预后及安全性方面仍然存在不足之处，而传统的中医药治疗具有经济安全、疗效稳定、维持时间长、复发率低、毒副作用小等优势和特色。长期从事中西医妇产科教学、临床、科研工作的武权生教授，在临床经验中总结出治疗功血的临床经验方益气养阴固冲方，在治疗气阴两虚证型无排卵性功血过程中具有显著的中医治疗特色。故本实验造模通过病证结合方法，观察临床经验方益气养阴固冲方对气阴两虚证型无排卵性功血大鼠子宫内膜基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)表达水平的影响，进一步从分子生物学角度探讨无排卵性功血的发病机制，并从益气养阴固冲方及其各组拆方治疗该病的药物机理进行研究，并依此优化组方，发挥中医药治疗该病的优势和特色，旨在为该方的临床应用提供一定价值和社会意义。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级雌性SD大鼠70只，体质量(200±20) g，3～4月龄，由甘肃中医药大学动物实验中心SPF级实验室提供(动物批号SCXK(甘)2011-0001-0000613)。

1.2 药物及试剂

补佳乐(戊酸雌二醇片)，拜耳医药保健有限公司广州分公司(批号J20080036)；氢化可的松注射液，国药集团容生制药有限公司(批号H20023069)；中药由甘肃中医药大学附属医院药剂科提供，中药水煎后过滤合并2次药液，浓缩成相当于原生药材2 g/ml的药液，冷却装入消毒的空瓶，置于4 ℃冰箱备用；益气养阴固冲方组成：黄芪30 g，党参15 g，炒山药15 g，煅龙骨30 g，煅牡蛎30 g，海螵蛸12 g，炒地榆15 g，茜草炭10 g，血余炭10 g，旱莲草15 g，仙鹤草15 g，炒蒲黄15 g，生地15 g，白芍15 g，杜仲15 g，炙甘草6 g。益气组：黄芪30 g，党参15 g，炒山药15 g，海螵蛸12 g。固冲组：炒蒲黄15 g，茜草炭10 g，血余炭10 g，仙鹤草15 g，炒地榆15 g。养阴组：生地15 g，白芍15 g，旱莲草15 g，煅龙骨30 g，煅牡蛎30 g。阳性对照药宫血宁胶囊，云南白药集团股份有限公司(批号Z20020087)；SP法免疫组化染色试剂盒、浓缩型DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 仪器

医学图像分析系统，成都泰盟，BI-2000型；拍照设备，山东易创MIE图像处理系统；光学显微镜，日本OLYMPUS，CX21X型；恒控磁力搅拌器，HKCB-3型，温州市医疗电器厂；轮转式切片机，美国AO-82型；电热恒温水浴锅，上海医疗器械厂；隔水式电热培养箱，PYX-PHS-B型，上海跃进医疗器械厂；电子天平，ES-1000E型，长沙湘平科技发展有限公司生产。

2 方法

2.1 造模

SPF级SD雌性大鼠70只，随机分出1组(5只)行假手术，每日正常喂食，并给予生理盐水灌胃作为空白对照组，其余大鼠行双侧卵巢去势手术[3]。

2.2 分组及给药

行卵巢去势术后第7天，待伤口愈合后使大鼠每日饥饿、疲劳游泳[4]；模型组同步灌胃给予补佳乐溶液1 ml/100 g，空白对照组连续灌胃14 d生理盐水1 ml/100 g。模型组在灌胃补佳乐第11天起时用“氢考型阴虚造模法。[5]”每只大鼠于每日17∶00连续灌服4 d 5 mg/mL氢化可的松注射液(剂量按50 mg/kg计算)。其余大鼠在补佳乐灌胃第15天起时按随机数字表法分为模型对照组、宫血宁组、益气组、固冲组、养阴组、全方组各5只，而后各组灌胃相应的不同药物，其剂量根据标准体质量给药：dB(mg/kg)=dA×KB/KA[6]，空白对照组及模型对照组连续5 d灌服生理盐水。

2.3 检测方法

末次灌胃给药40 min后大鼠称重脱颈处死，摘取子宫生理盐水冲洗，洗去血液用滤纸吸干，然后用10%中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋，切片后脱蜡至水，采用免疫组化S-P法试剂盒检测子宫内膜MMP-9、TIMP-1的表达水平。MMP-9、TIMP-1[7]的免疫组化染色强度通过图像分析系统定量分析，彩色图像分析仪测定的灰度数值可作为免疫组化片阳性区域表达的定量指标[8-9]。

2.4 统计学方法

3 结果

表1显示，在MMP-9及TIMP-1的灰度值中，模型对照组MMP-9表达显著低于空白对照组(P<0.01)，而TIMP-1表达明显高于空白对照组(P<0.05)；与模型对照组比较，各用药组MMP-9、TIMP-1表达差异有统计学意义(P<0.05)，固冲组、养阴组及益气组MMP-9表达差异有统计学意义(P<0.01)，固冲组、养阴组TIMP-1表达差异有统计学意义(P<0.01)；与宫血宁组比较，固冲组和养阴组MMP-9及TIMP-1表达均有所降低(P<0.05)，益气组和全方组MMP-9表达明显升高(P<0.05)，而益气组和全方组TIMP-1表达显著降低(P<0.05)；MMP-9/TIMP-1的比值中，全方组的比值是1，其次是宫血宁组，益气组次于前2组。

表1 益气养阴固冲方及其拆方对子宫内膜MMP-9、TIMP-1表达的影响

注：与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比较：△P<0.05，△△P<0.01；▲与宫血宁组比较：P<0.05

图1 光镜下大鼠子宫内膜MMP-9免疫组化染色(40×)注：A.空白对照组；B.模型对照组；C.宫血宁组；D.益气组；E.固冲组；F.养阴组；G.全方组

图2 光镜下大鼠子宫内膜TIMP-1免疫组化染色(40×)注：A.空白对照组；B.模型对照组；C.宫血宁组；D.益气组；E.固冲组；F.养阴组；G.全方组

4 讨论

育龄期妇女经历不同的周期性变化时，MMPs在其子宫内膜周期性增殖和脱落过程中发挥举足轻重的作用。MMPs是一组有锌离子依赖性的蛋白水解酶家族，在生化性能方面有着共同点，可使细胞外基质(ext racellular matrix, ECM) 有所降解，根据降解产物的不同可将其分为4型大约20 种[10]。MMP-9[11]是家族中分子量最大的明胶酶，在子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞中可以检测到，尤其在月经期和分泌期表达至最强。TIMP-1[12-13]是MMP-9的天然抑制剂，二者由同一细胞分泌产生，可与活化的MMP-9锌离子位点等量相结合，从而抑制MMP-9的生化活性，进一步参与调节ECM的降解过程。MMP-9、TIMP-1主要在子宫内膜腺上皮细胞的胞质中表达，但在间质细胞的胞质中则相对较少。

相关资料显示，维持正常ECM的降解和重建，理论上MMP-9/TIMP-1的比值需接近于1则可。而ECM[14]包括纤维黏连蛋白(FN)、层黏连蛋白(LN)和胶原蛋白等。ECM和血管基底膜的主要成分为IV型胶原，可黏合在血管的内皮细胞上，随着月经周期的变化，其含量也有所不同，能促进其在基底膜的黏附，对血管的内皮细胞起到支持作用，有助于血管的生成及其结构的稳定，还可结合整合素来稳固细胞彼此的黏合[15]。Galant[16]等在研究功血与MMP表达和活化的之间的关系时，发现不规则子宫出血患者出血期MMP-9含量显著升高，而TIMP-1水平则显著下降。

本实验结果显示，模型对照组大鼠的子宫内膜组织MMP-9表达水平有所降低，TIMP-1水平表达有所升高，从而使子宫内膜增厚甚则发生无排卵性功血，同时也从另一个方面说明本实验中无排卵性功血的动物模型制备成功。应用阳性对照药物宫血宁、益气养阴固冲方全方及各拆方组药物治疗后，各治疗组MMP-9表达水平升高，TIMP-1水平表达下降，而以全方组和益气组改变更为明显。说明益气养阴固冲方全方组药物的治疗效果优于宫血宁组，而益气组药物的治疗疗效较全方组药物明显，且二者在功效上有相似之处。

MMP/TIMP的比值接近1则能维持正常细胞外基质降解和重建的功能，可以促进血管的形成并稳定血管结构，MMP、TIMP是一个平衡组对，在本实验中，全方组两者的比值最接近1，宫血宁组次之，而后是益气组，说明益气组对于血管内皮的修复作用要优于其他各组，也说明方中君药益气组可益气生津、止血养血，益气养阴固冲全方对血管生成有促进作用，从而促进功血患者子宫内膜的修复，可有效维持机体内环境的稳定，治疗气阴两虚证型的无排卵性功血。