周小琳，冯晟楠，林美娇，欧阳竞锋

(1.南阳医学高等专科学校，河南 南阳 473061；2.北京中医药大学附属东直门医院,北京 100700；3.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见而难治的慢性微血管并发症，也是导致慢性肾功能衰竭的重要原因之一。近年来，国内外专家对糖尿病肾病的研究十分重视。但迄今为止，现代医学对糖尿病肾病尚缺乏有效的治疗方法。研究认为，糖尿病肾病的病机是阴精不足，导致肾气等化源不足，继而产生痰、湿和血瘀等邪实停留病机[1]。笔者认为，糖尿病肾病发病源于脾肾亏虚，以水湿浊毒瘀阻为标，其临床表现多与《伤寒论》少阴证相似，故以健脾利湿祛瘀为主，自拟参藤三黄汤治疗糖尿病肾病。

前期的临床研究[2-3]发现，参藤三黄汤在减少糖尿病肾病患者尿蛋白、延缓肾病进展和缓解症状方面具有很确切的疗效。本实验拟通过观察参藤三黄汤对糖尿病肾病大鼠血糖、血尿素氮、肾脏病理改变以及NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant responsive element, ARE)信号通路关键分子等相关指标的影响，以探索参藤三黄汤治疗糖尿病肾病的可能作用靶点，为研制防治糖尿病肾病的有效方法和药物提供科学依据。

1 实验材料

1.1 药品和试剂

参藤三黄汤组成：黄芪60 g，黄连20 g，生地黄20 g，葛根30 g，丹参30 g，鸡血藤30 g，枸杞15 g，山萸肉30 g，山药20 g。链脲佐菌素 (streptozotocin，STZ) 购自 Sigma公司 (货号S0130)；尿素氮(BUN)、肌酐(Scr) 检测试剂盒(上海科华生物工程有限公司)，尿白蛋白、尿蛋白检测试剂盒(武汉博士德有限公司)；兔抗大鼠 TGF-β1多克隆抗体、兔抗大鼠 CTGF 多克隆抗体(武汉博士德有限公司)；厄贝沙坦片(安博维) 购自赛诺菲(杭州) 制药有限公司(批号5A154)。

1.2 实验动物

清洁级健康雄性 SD 大鼠 60 只，体质量 160～180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号 SCXK(京) 2012-0001)，全部饲养于中国中医科学院动物实验中心(室温20～24 ℃，空气相对湿度 50%～70%，昼夜循环12 h，自由进食。

1.3 主要设备

奥林巴斯 BX51 光学显微镜显微镜(日本奥林巴斯株式会社)，Anke TDL-40B 型低速大容量冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)，PVDF 膜(美国 Millipore 公司)，IX51 型显微镜(日本 Olympus 公司)。

2 方法

2.1 糖尿病模型建立

SD 大鼠雄性大鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法分为正常对照组10只和 STZ 诱导组70只，分别给予普通饲料及高脂饲料。饲养4周后，腹腔注射STZ(60 mg/kg)诱发糖尿病，对照组则腹腔注射等体积生理盐水。注射1周后尾静脉采血测定空腹血糖，如果2次空腹血糖均超过16.7 mmol /L、尿糖阳性、尿量大于对照组的150%、尿蛋白排泄>30 mg /24 h，可认为糖尿病模型造模成功[4～6]。

2.2 分组及给药

糖尿病模型动物按随机数字表法分为模型组(DN)、阳性对照组(厄贝沙坦组)及参藤三黄汤高剂量组、参藤三黄汤中剂量组、参藤三黄汤低剂量组，正常大鼠为正常对照组。正常组10只，其他组别每组9～10只。高剂量组每日1次灌胃给予10 g/kg体质量，中剂量组每日1次灌胃给予5 g/kg体质量，低剂量组每日1次灌胃给予2 g/kg体质量，厄贝沙坦组每日每只灌胃厄贝沙坦片(15 mg/kg/d)，正常对照组和模型组每日1次灌胃生理盐水。除正常组外，其余各组大鼠继续腹腔注射STZ(60 mg/kg)，连续12周[7-8]。用药结束后，取部分肾组织，RT-PCR检测Nrf2、ARE的基因和蛋白表达情况。

2.3 大鼠体质量、血液及尿生化指标检测

使用DT-2000 型电子天平每周测定大鼠体质量，使用血糖仪监测大鼠空腹血糖。第12周，末次给药后 24 h 禁食不禁水，收集 24 h 尿液使用Olympus AU-2700型全自动生化分仪检测；10% 的水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血离心取上清，血清送生化仪检测血肌酐(SCr)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHOL) 及白蛋白(Alb)。尿素氮和甘油三酯用试剂盒比色法检测，血肌酐和胆固醇用酶法检测，血糖用己糖激酶法检测，均按照说明书操作。

2.4 肾脏病理改变

大鼠取血结束后，手术剥离大鼠两侧肾脏，将去掉包膜的肾脏纵向剖开，留取包括肾髓质及肾皮质的完整扇形组织。左侧肾脏组织 4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋切片(4 μm)，常规 HE 染色，光学显微镜(×400) 观察大鼠肾小球病理改变，使用 JEDR801D 形态学图像分析系统软件采集图像。

2.5 蛋白免疫印迹法检测大鼠肾组织中Nrf2、ARE蛋白表达

肾脏组织解冻匀浆、充分裂解提取总蛋白，分光光度计测定蛋白浓度，取蛋白样品电泳转移至 PVDF 膜，室温封闭2 h，Nrf2、ARE以及β-actin一抗孵育过夜，PBS充分洗涤后，分别用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，洗涤后室温显影，凝胶成像系统拍照、封存。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 一般情况

正常组的大鼠饮食正常,体质量增加，灵活好动,毛发光滑，排尿排便无异常。其余糖尿病肾病模型大鼠自造模日起出现多饮、多食、多尿、体质量迅速减轻等临床症状，大鼠精神不振，活动减少，毛发杂乱无光泽，有脱毛现象，大便次数多。

3.2 常规生化指标检测结果

表1显示，与正常对照组比较，模型组大鼠体质量降低，而血糖、24 h 尿蛋白量、血清肌酐、尿素氮均明显增加(P<0.01)。与模型组大鼠比较，其他各剂量组及阳性药组大鼠血糖、24 h 尿蛋白量、血清肌酐、尿素氮均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与厄贝沙坦组比较，参藤三黄汤高、中剂量组血糖、血清肌酐、血尿素氮水平及24 h 尿蛋白定量差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠体质量及血糖、血清肌酐、血尿素氮、24 h 尿蛋白水平比较

注:模型组与正常对照组比较：**P<0.01; 与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

3.3 病理分析结果

图1显示，HE 染色结果正常组SD大鼠肾小球毛细血管球结构清晰，肾小球滤过膜结构完整，无增厚、皱曲等病理改变，大鼠肾小管结构清晰，肾间质无炎性反应和细胞浸润现象。模型组大鼠肾小球体积明显缩小，毛细血管球结构被破坏，部分肾小球组织纤维化样改变，毛细血管腔狭窄，滤过膜增厚，肾小管萎缩，肾间质血管增生。经厄贝沙坦及参藤三黄汤干预后，大鼠肾小球病变均有所改善，毛细血管球结构明显恢复，毛细血管腔狭窄状况缓解。

图1 参藤三黄汤对大鼠DN肾组织病理变化的影响(HE ×200)注：A． 空白组; B．DN模型组; C.厄贝沙坦组;D～F.参藤三黄汤高、中、低剂量组

3.4 各组大鼠肾组织Nrf2、ARE蛋白表达

图2显示，与模型组比较，厄贝沙坦组以及参藤三黄汤中剂量各组Nrf2、ARE蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P>0.05); 与正常组比较，模型组Nrf2、ARE蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P< 0.05);与厄贝沙坦组比较，参藤三黄汤各剂量组Nrf2、ARE蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 参藤三黄汤对大鼠DN肾组织Nrf2和ARE表达的影响(HE ×200)注：A． 空白组; B．DN模型组; C.厄贝沙坦组; D～F.参藤三黄汤高、中、低剂量组Nrf2, NF-E2相关因子2; ARE, 抗氧化反应元件

4 讨论

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见并发症，也是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一。据统计，在年龄超过25周岁的2型糖尿病患者中，10.8%的糖尿病患者患有DN[9]。目前研究认为，多种机制参与包括DN在内的糖尿病并发症的发生发展。尽管吡哆胺和其他新兴药物具有治疗DN的效果，但是还没有足够的证据让其应用到临床治疗中[10]。近年来临床研究显示，中药及中药复方可有效地改善患者的临床症状，减轻患者的 DN 损伤[11]。

糖尿病属于中医学“消渴”“肥胖”范畴，指多饮、多食、多尿且形体消瘦。刘完素指出：“二者心膈有热，久则引饮为消渴耳。”并选用麦门冬饮子益气养阴、生津止渴治之，并著有《三消论》。认为消渴有三：“若饮水多而小便多者，名曰消渴；若饮食多而不甚饥，小便数而渐瘦者，名曰消中；若而饮水不绝，腿消瘦而小便有脂液者，名曰肾消。”成为后世分消渴为上消、中消、下消之宗本。消渴日久则生它变，一则阴损及阳，阴阳俱损；二则病久入络，血脉瘀滞;三则损伤脾胃，痰饮内生，耗伤气阴。这与现代医学发现糖脂代谢紊乱导致糖基化终末代谢产物出现[12]、内皮细胞损伤、增加肾小球基底膜通透性、损伤血管，从而造成肾小球硬化的病理过程如出一辙。可见，久虚是糖尿病肾病的发病基础，邪实则是指糖尿病及其并发症等[13-14]。

参藤三黄汤药物组成是依据糖尿病治疗应以益气化瘀、清热生津、补肾固精为原则而立。方中黄芪味甘、性微温，归肺脾经益气固表、补脾益肺，为补气升阳之圣药；丹参味苦性微寒，归心肝经活血凉血、祛瘀止痛；鸡血藤味苦微甘、性温，归肝肾经行血补血、舒筋活络，二者共为君药；黄连味苦性寒，清热燥湿，泻火解毒；生地黄味甘苦、性寒清热凉血，养阴生津；枸杞子味甘性平，归肝肾经，补肝肾、益精血，为平补肝肾之良药；山萸肉味酸、涩性温，补益肝肾，涩精固脱；山药味甘性平，补脾养胃，生津益肺，补肾涩精，为平补三焦良药。尤其主要药物黄芪、丹参两药合用益气升阳、活血化瘀，再配鸡血藤补血活血，可气旺血行，血行瘀散，益气化瘀，活血通络；生地黄配葛根清热凉血、养阴生津，使热清津生，口渴可止；黄连善清胃火，与生地黄同用能清热泻火、滋肾养阴，以解消谷善饥；枸杞子、山萸肉、山药三药同用平补肝肾，固肾涩精。全方补中有动，行中有补，补而兼涩，补而不峻，共奏益气升阳、化瘀通络、养阴清热、补肾涩精之效。前期的研究表明，参藤三黄汤的使用可增加胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗，促进胰岛素分泌，增加血清胰岛素的含量，促进外周组织和靶器官对糖的利用，延缓肠道对葡萄糖的吸收，清除自由基、抗脂质过氧化及纠正脂肪蛋白质代谢紊乱，改善血流变性和微循环等。

氧化应激是糖尿病肾病的重要发病机制。近年来，越来越多的研究集中到氧化应激对糖尿病肾病的影响。氧化应激是指机体在受到有害刺激时，活性氧簇 (ROS) 产生过多，超过了机体抗氧化防御系统清除能力，导致氧化系统平衡紊乱和组织细胞损伤。在高糖状态下，氧化应激增强可通过多种途径引起足细胞凋亡、肾小球滤过膜的物理屏障和电荷屏障损伤、肾脏血流动力学改变、细胞外基质聚积、蛋白尿等，诱导糖尿病肾病的发生发展。各种因素导致的炎症因子聚集，引发肾小球局部纤维化，是糖尿病肾病的基本病理变化[15]。因此，提高机体抗氧化能力是减缓 DN 病情进展的有效策略。

抗氧化因子核因子相关因子2 (NF-E2-related factor 2, Nrf2)在机体抗氧化系统中起核心作用[16]。Nrf2属于帽和领(cap‘n’collar, CNC)转录因子家族成员，在体内发挥调节氧化还原状态的重要作用，体内有许多酶参与内源性抗氧化物的活化[17]。生理条件下，作为Nrf2的抑制剂，肌动蛋白结合蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 (Keap1)与Nrf2 结合并使其位于胞浆内，从而阻止 Nrf2 进入细胞核发挥转录活性，位于胞浆内的Nrf2 进而被泛素化，并在蛋白酶体内被降解；在内外界自由基和化学物质刺激时，Keap1 的构象改变或被Nrf2磷酸化，导致Nrf2与Keap1 解离而活化，活化的Nrf2 进入细胞核，与抗氧化反应元件(ARE)结合，启动ARE 下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶体以及分子伴侣等基因转录和表达，从而发挥其抗氧化、解毒以及抗炎的作用，以抵抗内外界的有害刺激[18-19]。越来越多的证据表明，Nrf2的活化以及表达上调可以预防或延缓包括DN在内的糖尿病并发症。

本实验从糖尿病肾病大鼠模型的整体水平上，研究参藤三黄汤对Nrf2/ARE信号通路中关键分子表达的影响，初步证明Nrf2 的活化可上调一系列Keap1/Nrf2 通路依赖的抗氧化基因而发挥间接抗氧化作用，从而预防和缓解包括DN在内的糖尿病并发症的发生和发展，对于深入研究Nrf2/ARE信号通路在对抗大鼠糖尿病肾病中的作用，综合探讨参藤三黄汤对Nrf2/ARE信号通路的综合调控机制，探究糖尿病肾病防治的新策略具有一定意义。