李璟 蒋娜 王晶晶 马兴建 王家宾

摘 要：目的 观察右美托咪定对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法 H9C2心肌细胞随机分为三组：正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）、Dex（5 μmol/L）干预H/R组。Dex干预H/R组先用Dex预处理6 h后，再经缺氧/复氧处理。采用倒置显微镜观察各组H9C2心肌细胞形态的变化，检测各组细胞培养基中LDH的含量，CCK-8法检测各组H9C2心肌细胞的存活率，试剂盒检测caspase-3活性，TUNEL法检测细胞凋亡并计算凋亡指数。结果 与Control组相比，H/R组细胞皱缩，大量死亡，细胞活力降低，培养基中LDH含量增加，caspase-3活性增加，细胞凋亡指数增加，统计学意义显著（P<0.01）；Dex预处理可明显改善H/R处理后细胞形态，提高细胞活力，减少LDH含量和caspase-3活性，降低细胞凋亡指数，统计学意义显著（P<0.01）。结论 Dex可通过减少H9C2心肌细胞缺氧/复氧引起的细胞凋亡减轻损伤。

关键词：右美托咪定；H9C2；缺氧/復氧；细胞凋亡

中图分类号：R917 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.09.025

文章编号：1006-1959（2018）09-0083-04

Abstract：Objective To observe the protective effects of dexmedetomidine on hypoxia/reoxygenation injury of H9C2 cardiomyocytes. Methods H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into three groups： normal control group（Control），hypoxia/reoxygenation group （H/R）and Dex（5μmol/L）intervention group.Dex intervention in group H/R was treated with Dex pretreatment for 6 h before anoxia/ reoxygenation.The morphologic changes of H9C2 cardiomyocytes in each group were observed by inverted microscope.The content of LDH in the cell culture medium of each group was detected.The survival rate of H9C2 cardiomyocytes in each group was detected by CCK-8 method.The activity of caspase-3 was detected by the kit.The apoptosis was detected by TUNEL method and the apoptosis index was calculated.Results Compared with the Control group，the cells in the H/R group were shrinking，a large number of deaths， the decrease of cell vitality，the increase of LDH content in the medium，the increase of the activity of caspase-3，the increase of the apoptosis index，and the significant statistical significance（P<0.01）.Dex pretreatment could obviously improve the morphology of the cells after H/R treatment，raise the vitality of the cells，reduce the content of LDH and caspase-3 activity decreased the apoptotic index，and the difference was statistically significant（P<0.01）.Conclusion Dex can reduce the injury of H9C2 cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation.

Key words：Dexmedetomidine；H9C2；Hypoxia/Reoxygenation；Apoptosis

缺血性心脏病是导致死亡的一类主要的心血管疾病，严重危害人类健康，及时有效的恢复缺血心肌的血流-即再灌注，是临床治疗的首选，然而缺血心肌恢复血流的同时会加重心肌损伤和能量代谢障碍，形成心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI）[1-3]。右美托咪定（dexmedetomidine， Dex）是一种新型的高选择性α2受体激动剂，被广泛应用于心血管手术的麻醉，并收到了较好的效果。Dex在心血管疾病中发挥保护作用，但具体机制仍不清楚。Dex具有剂量依赖性的镇静、镇痛、抗焦虑和抑制交感神经兴奋等作用，且对呼吸、循环的抑制作用轻微[8-10]。Dex对心肌的保护作用受到越来越多的关注，普遍认为Dex是通过抑制交感中枢活动，降低心率，降低心肌氧耗，改善心肌氧供需平衡，但具体机制仍未阐明。本研究采用H9C2心肌细胞缺氧/复氧模型，观察Dex预处理对缺氧/复氧损伤的影响及其可能机制，现分析如下。

1材料与方法

1.1材料与仪器 H9C2心肌细胞系购买自深圳百恩维公司；DMEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司；0.25 %胰蛋白酶购自Sigma公司；盐酸右美托咪定购自江苏恒瑞医药有限公司（200 μg/2 ml）；CCK-8细胞毒性检测试剂盒购自七海生物公司；LDH检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，抗Bcl2、抗Bax和抗GAPDH抗体均购自Cell Signaling公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。超净工作台购自苏州净化设备仪器厂；CO2细胞培养箱购自Thermo公司；低速离心机购自赛特湘仪公司；Western-blot相关仪器均购自Bio-Rad公司；酶标仪购自SpectraMax公司。

1.2 H9C2心肌细胞的培养和H/R模型的建立用含10 %胎牛血清的DMEM培养液在37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育H9C2细胞；H/R模型通过将H9C2细胞正常培养基换为无血清的DMEM并在缺氧箱中處理12 h，之后将无血清的DMEM换成含10 %胎牛血清的DMEM培养液后放入正常培养箱中孵育4 h。

1.3 实验分组将H9C2细胞随机分为三组：正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）和右美托咪定干预缺氧/复氧组（Dex+H/R）。Dex+H/R 组先用Dex预处理6 h，再进行H/R处理。

1.4 CCK-8法检测各组细胞活力各组实验结束后，将培养基倒掉，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，再加入100 μl无血清的培养液和10 μl CCK-8检测液，在37 ℃细胞培养箱中避光孵育2 h，酶标仪检测各孔OD值，波长为450 nm。

1.5 各组细胞培养液中LDH的检测各组实验结束后，收集每组培养瓶中细胞培养液，严格按照南京建成生物工程研究所提供的检测试剂盒说明书操作，酶标仪检测各孔OD值，波长为450 nm，将各组读数与Control组比较。

1.6 TUNEL法检测细胞凋亡各组实验结束后，用PBS清洗3次，10 min/次；用0.1 %的Triton-X室温破膜10 min，再用PBS洗3次，10min/次；按照TUNEL试剂盒说明，将1号液和2号液按1：9混合，37 ℃水浴避光孵育2 h；再用PBS洗3次，10 min/次，DAPI染液避光染核37 ℃水浴10 min，再用PBS洗3次，10 min/次。激光共聚焦显微镜拍照，细胞凋亡指数=绿色细胞核数/蓝色细胞核数×100%。

1.7 统计学处理采用Prism 5.0统计软件进行数据分析，实验结果用（x±s）表示，用单因素方差分析比较两组之间的统计学差异，并用Bonferroni法进行校正，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示统计学意义显著。

2结果

2.1 Dex对H/R损伤后H9C2细胞活力的影响与Control组相比，H/R处理后降低H9C2细胞活力（P<0.01），倒置显微镜下观察发现，细胞皱缩，大量死亡；与H/R组相比，Dex干预H/R组细胞活力得到改善（P<0.01），细胞皱缩减轻，死亡减少，见图1。

2.2 Dex对H/R损伤后H9C2细胞培养液中LDH含量的影响与Control组相比，H/R处理后培养液中LDH含量升高（P<0.01）；与H/R组相比，Dex干预H/R组培养液中LDH含量降低（P<0.01），见图2。

2.3 Dex对H/R损伤后H9C2细胞caspase-3活性的

影响与Control组相比，H/R处理后培养液中LDH含量升高（P<0.05）；与H/R组相比，Dex干预H/R组培养液中LDH含量降低（P<0.05），见图3。

2.4 Dex对H/R损伤后H9C2细胞凋亡的影响与Control组相比，H/R处理后细胞凋亡增加，凋亡指数增大（P<0.01）；与H/R组相比，Dex干预H/R组后细胞凋亡减少，凋亡指数降低（P<0.01），见图4。

3讨论

心脏缺血/再灌注损伤已经成为制约缺血性心脏病患者预后的重要因素，极大的限制了临床上药物溶栓、动脉搭桥术和经皮冠状动脉成形术等的治疗效果。如何有效减轻缺血/再灌注损伤成为了心血管研究领域的焦点。Dex作为一种新型的α肾上腺素受体高选择性激动剂，具有剂量依赖性的镇静、镇痛、抗焦虑和抑制交感神经兴奋等作用，且对呼吸、循环的抑制作用轻微 [4-6]。Dex对心肌的保护作用受到越来越多的关注，普遍认为Dex是通过抑制交感中枢活动，降低心率，降低心肌氧耗，改善心肌氧供需平衡，但具体机制仍未阐明。

以往研究表明，Dex预处理可激活α肾上腺素能受体，减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤。Dex还可能通过抑制mPTP的开放及线粒体ATP敏感性钾通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel， mitoKATP）的活性减少心肌损伤[4，7]。细胞凋亡是心肌细胞损伤的重要机制，是由基因控制的程序化死亡过程[4]。有研究证实，细胞凋亡是缺血再灌注损伤中细胞死亡的主要方式[8，9]。H9C2细胞系是大鼠胚胎心肌组织的亚克隆细胞株，可用于模拟心肌细胞的各种病理模型，在心肌保护的机制研究中发挥重要作用[10，11]。线粒体途径在细胞凋亡中发挥重要作用，caspase-3是caspase家族中关键的效应分子，其活性增加是线粒体凋亡发生的重要标志[12，13]。本研究发现，在H9C2心肌细胞H/R时，细胞皱缩，大量死亡，LDH释放增多，caspase-3活性明显增加，而Dex预处理后，可明显减少细胞死亡和LDH释放，抑制caspase-3活性。这些结果说明，Dex可通过抑制细胞凋亡减轻H9C2心肌细胞H/R损伤。

本研究发现，Dex预处理可明显减少细胞凋亡从而减轻心肌缺血/再灌注损伤，然而Dex減少细胞凋亡是否依赖于线粒体，Dex减轻心肌缺血/再灌注损伤有无其它的作用靶点，相关的机制仍未阐明，具体信号分子有待进一步的研究。

综上所述，本研究证实Dex可通过减少细胞凋亡在心肌细胞缺血/再灌注损伤中发挥重要保护作用，是一种潜在的缺血/再灌注心肌保护药物。本研究为临床上应用Dex干预心血管疾病提供了实验依据。但具体的信号机制有待深入的研究。

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收稿日期：2017-11-8；修回日期：2017-11-14

编辑/李桦