李华杰 徐雄峰 邱波

[摘要] 间充质干细胞（MSCs）来源广泛并具有多向分化潜能，被视为组织修复重建领域的新希望。但近年的研究表明，传统的贴壁培养模式改变了细胞生长的原始环境，会导致MSCs自主分化、干性衰退等诸多问题，移植体内后治疗效果不佳。研究证据表明，相较于传统的贴壁培养，3D-球体培养方式对MSCs的生物活性具有显著促进作用。壳聚糖薄膜（CM）培养是一种新型生物膜诱导MSCs成球方法，本文主要从MSCs形态学、生物功能的变化及其潜在机制方面对MSCs的CM成球培养模式进行综述，并探讨其在MSCs临床应用方面的潜力。

[关键词] 间充质干细胞；3D-球体；壳聚糖薄膜；干性

[中图分类号] R318 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（b）-0021-05

Research progress and clinical application prospect in 3D-sphere culture of mesenchymal stem cell with chitosan membrane

LI Huajie XU Xiongfeng QIU Bo

Department of Orthopedics， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Mesenchymal stem cells （MSCs） with a wide range of sources and multipotential differentiation are thought as a new hope in the field of tissue repair and reconstruction. However， recent research shows that traditional adherent culture changes the initial growing environment of MSCs， leading to self-differentiation， stemness recession and other problems， which brings a negative effect to the treatment after in vivo transplantation. And the evidence suggests that， compared with the traditional adherent culture， the 3D-sphere culture plays a significant role in promoting the biological activity of MSCs. Chitosan membrane （CM） culture is a new type of biomaterial substrate-mediated multicellular spheroid cultivation for MSCs. This review discusses the CM culture of MSCs mainly from the change of morphology， biological functions and potential mechanisms， as well as its potential in clinical application.

[Key words] Mesenchymal stem cells； 3D-sphere； Chitosan membrane； Stemness

近年來，干细胞尤其是间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）越来越受到医学研究者的重视，因其具有多向分化潜能被视为组织修复领域的新希望。原代MSCs可以从脂肪、脐带、软骨、牙龈等多种组织中获取[1-2]，特定条件下可分化为脂肪、骨、软骨等多种类型细胞，在减少肾损伤、肝组织再生、增强伤口愈合等方面均被证实发挥治疗作用[3]。然而，近年学者们发现贴壁培养扩增的MSCs生物活性较低[4]，究其原因，MSCs体外平铺式的生长状态与其生物体内的团块聚集模式有很大差异，微环境的改变使MSCs丧失了部分干细胞特性[5]。例如，体外培养通常不能够维持MSCs的性状稳定，自主分化、干性衰退，归巢能力减弱等问题亟待解决[6-7]。壳聚糖薄膜（chitosan membrane，CM）培养是一种新型的生物膜细胞培养法，此种方式可诱导MSCs自发形成细胞球体，对其干细胞特性、移植活力、旁分泌效应、迁徙趋化等生物功能均有促进作用[8]。本文将对CM培养诱导的MSCs球体在形态学、生物功能上的变化及其潜在机制进行综述，并分析其临床应用前景。

1 制备CM作培养基底物

壳聚糖是广泛存在于大自然界中的甲壳素衍生物，是一种带正电荷的天然多糖，作为组织工程支架材料被广泛研究[9-10]。制备CM通常取壳聚糖粉末在1%乙酸水溶液中溶解并在室温下搅拌12 h以获得1%壳聚糖溶液，以1.5mL/孔均匀涂布于6孔细胞培养板，置于层流柜蒸发24 h。细胞实验前，形成的CM紫外线暴露过夜，然后用0.5 mol/L NaOH溶液中和处理30 min，用蒸馏水充分洗涤，最后用磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤[11]。

2 CM底物培养的MSCs细胞形态学变化及其潜在机制

常规聚苯乙烯平板表面接种后，MSCs表现为成纤维细胞形态的贴壁细胞，增殖后聚集成簇，而在CM作为底物的的培养条件下单个细胞的体积明显较小，短暂贴壁后聚集为球状体，并进行性增大[12]。在其他物理方式诱导的MSCs成球培养体系中黏附力较低，细胞之间先通过细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和整合蛋白的相互接触从而形成松散的多细胞团块，之后细胞间的接触愈加频繁，细胞团块逐渐聚拢，最终变成致密的细胞球[13]。而采用黏附力较强的CM作为底物的培养体系中，MSCs成球原理则完全不同，CM上的MSCs运动活跃，细胞先在基底膜黏附并伸展，然后收起伪足聚集成团，细胞球体间也会发生再融合[12]。

研究表明CM底物诱导MSCs成球的一系列过程与CM释放的钙密切相关。实验中观察到CM上的MSCs球状体细胞内的钙水平显著升高，证实了壳聚糖结合的钙进入细胞，而减小CM的厚度以及加入EGTA（一种Ca2+螯合剂），发现MSCs球体的直径减小，这可能是改变了钙储库容量的结果[14]。因此，CM可能通过其表面结合的钙转移到MSCs中，影响细胞基质和细胞间的相互作用，从而对成球发挥作用。钙黏蛋白在细胞间力传导中发挥重要作用，研究证实CM上MSCs球体的N-钙黏蛋白表达上调，其可能通过整合素相关通路调节以促进MSCs球体的产生；同时研究发现CM诱导的MSCs球体中各种钙相关基因表达上调，证实了钙信号在CM形成的MSCs球体中的关键作用，这在其他球体培养系统中尚未见报道[11]。此研究还在壳聚糖膜上发现与细胞黏附迁移有关的基因，如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）。MMP是降解ECM的蛋白水解酶，在细胞迁移以及ECM蛋白和黏附分子的加工中起重要作用[15]。这些与CM上观察到的MSCs高迁移率一致，而CM上的MSCs的活跃运动可能促进了MSCs球体的形成。尽管观察到基因、蛋白质表达的一些变化，但是在CM诱导MSCs球体形成的确切机制还尚未阐明，而MSCs在CM上形成球体后的“3D效应”也是其生物学功能发生变化的重要基础[12]。

3 CM培养MSCs的生物学功能改变

3.1 CM诱导的MSCs球体的干性基因表达

研究证实，转录因子Oct4、Sox2和Nanog对维持多能胚胎干细胞分化潜能至关重要[16]，这些干性标志物基因同样存在于成体干细胞中[17]。通过基因分析证实了CM上MSCs球体的Oct4、Sox2和Nanog的表达水平较常规培养显著上调，且在经过转化生长因子-β3（transforming growth factor-βtype 3，TGF-β3）诱导后，壳聚糖膜上MSCs球状体表现了更好的中软骨细胞分化能力，有更高的糖胺聚糖及Ⅱ型胶原表达水平[18]；CM培养的MSCs细胞球体通过5-氮杂-2-脱氧胞苷诱导后，心脏标志物基因（Gata4、Nkx2.5、Tnnt2和Myh6）的表达水平较平板培养也显着提高[14]。这些证实了CM成球培养对MSCs的干性维持及多向分化具有促进作用。

很多研究者认为干性基因的维持与球体形成现象高度相关，这在其他MSCs球体培养体系中也被证实[13]，与非黏附性材料聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）表面形成的球体对比发现CM诱导形成的MSCs球体更大，且有更高的干性基因表达水平[11]。这表明除了诱导MSCs形成细胞球体本身之外，MSCs与CM底物之间的相互作用对MSCs的干性维持也可能发挥了作用。

3.2 CM诱导的MSCs细胞球体的活力与移植活性

研究者通过台盼兰染料排斥实验来评估单层和球体细胞中存活的MSCs的百分比，发现CM培养的MSCs球体与平板培养的MSCs，细胞活力均超过95%；为了评估球体细胞的增殖潜力，将MSCs球体用胰蛋白酶解离并接种回聚乙烯平板培养，与单层MSCs相比，球体衍生的MSCs在开始时表现出较慢的增长，但是在稍晚的时间点即开始出现较为活跃的增殖过程。在进一步的动物实验中，将数量相同的CM底物诱导MSCs球體解离细胞和平板培养的细胞分别注射入裸鼠后肢中，CM组中检测到了更高水平的抗人核抗原（human nuclear antigen，HNA）水平，MSCs薄膜诱导的球体MSCs表现出了更好的滞留作用及增殖潜力[19]。因此，若在移植前通过CM培养法移植治疗前诱导MSCs形成球体，可能会显著提升治疗效果。

3.3 CM诱导的MSCs球体的黏附迁移趋化能力

研究发现CM的MSCs的基质金属蛋白酶MMP家族基因表达上调，这与MSCs在CM上的高迁移率现象一致。此外还观察到在壳聚糖上MSCs球体中控制细胞间黏附的多种基因上被上调，包括钙黏蛋白、细胞黏附分子、Notch和肝配蛋白受体等，此类细胞黏附基因表达的增强可以使细胞在球体形成中更好地进行通讯及协调。相对平板培养，CM上MSCs球体细胞的趋化因子及其受体的上调尤其具有重要意义[11]，结果显示编码趋化因子样受体1（chemokine like receptor 1，CMKLR1）的基因高表达（约50倍）。它同时也是chemerin受体23（Chemerin Receptor 23，ChemR23），而Chemerin/CMKLR1相互作用也被报道可促进脂肪形成和血管生成[20]；其他上调的趋化因子受体或配体包括趋化因子受体4和7（chemokine receptor type 4 andtype 7，CXCR4和CXCR7），它们是基质衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF1）的受体，而CXCR4是研究最多的趋化因子受体之一，在细胞迁移，增殖和分化中发挥重要作用[21]。而表达上调的单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和MCP-3对MSCs来说则是重要的归巢因素[11]。由于迁移趋化功能对MSCs的治疗性能至关重要，CM诱导的MSCs球状体的迁移和趋化性值得进一步深入研究。

3.4 CM培养的MSCs细胞球体的抗炎抗肿瘤作用

有研究表明，与平板培养相比，球体培养模式中对MSCs旁分泌具有增强作用，比如骨髓来源MSCs球体分泌的抗炎因子TNF-α刺激基因6（TNF-α stimulated gene 6，TSG-6）可在小鼠心肌梗死中有效减轻炎性反应[22]；白细胞介素24（Interleukin 24，IL-24）的分泌的增加能降低肿瘤细胞的活性[23]，而CM诱导的球体MSCs也被证实具有类似的生物学性能改变[11]。CM培养MSCs细胞球体中许多抗炎基因的表达水平上调，包括白细胞介素1受体拮抗剂（interleu-kin-1 receptor antagonist，IL1RN）、白细胞介素4诱导的蛋白1（Interleukin 4 induced protein 1，IL4I1）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）等。肿瘤坏死因子超家族成员9（recombinant tumor necrosis factor receptor superfamily，member 9，TNFSF9）也被上调，其可通过CD137受体/配体系统介导免疫抑制和免疫刺激[24]。而上调的LIF、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）被认为是与MSCs的免疫调节性质有关的因子[25]。这类基因在移植物抗宿主病和自身免疫性疾病的临床治疗中发挥重要作用。

同时发现CM上MSCs有少量抗肿瘤基因上调。尤其是CM上MSCs观察到高表达的IL-24基因。IL-24被认为是一种肿瘤抑制基因，可以选择性地诱导癌细胞凋亡，而不影响正常细胞[26-27]。肿瘤蛋白p53（tumor protein 53，tp53）是另一种上调的肿瘤抑制基因，涉及多种关键的细胞功能，如增殖、细胞周期停滞、细胞凋亡和DNA修复机制[28]。这些结果表明CM培养促进了MSCs的分泌功能，在减轻炎症及抗肿瘤方面具有广阔的应用潜力。

4 CM诱导的MSCs球体生物学功能改变的潜在机制

4.1球体效应

类似其他三维细胞培养体系，CM形成的MSCs球体是个复杂的多细胞聚合体，这种“球体效应”无疑是MSCs生物活性变化的重要基础。

首先，MSCs球体营造的轻度缺氧环境可能比正常培养条件下（21%O2）更接近MSCs的自然生长状态（例如骨髓中的O2张力为1%～7%），MSCs可以从缺氧中受益，从而抑制衰老，增加增殖，并增强其间充质谱系的分化潜能[29-30]。其次，球体结构为MSCs细胞间接触提供了更好的三维空间，通过紧密的联系，促进细胞间物质信息交换能力。比如观察到CM上MSCs球体的EphA7上调，其在轴突受体传导通路中发挥重要作用，而此类细胞黏附基因的增强可在MSCs球体中提供更好的细胞通讯和协调功能，从而使MSCs球体更好的发挥生物学活性[11]。同时，CM上球体的形成，更大程度发挥了ECM对MSCs的支持作用。研究发现球体MSCs的ECM合成效率较贴壁培养模式显著增强，ECM可通过细胞膜表面的整合蛋白将信号传入细胞内，从而系统地调控细胞的生命活动[31]。而关于CM上MSCs的球体效应对MSCs 的影响仍然需要进一步的深入研究。

4.2 细胞底物相互作用

通过分析CM底物衍生的3D MSCs球体对2D培养的MSCs的基因表达谱，证实了诸多底物依賴性基因的参与诱导MSCs球体的产生并促进其生物活性，而这种细胞底物作用机制也是CM培养方式与其它3D培养体系的本质区别。钙相关基因的特异性调节可能参与了CM上MSCs球体的产生，同时黏附迁移及抗炎抗肿瘤相关基因表达上调，这在上文中已经提到。通过CM与PVA分别诱导形成球体，结果发现CM上MSCs的相关基因表达上调较PVA更加明显，CM的持续调节效应与PVA的瞬时上调表明了细胞-底物相互作用在MSCs基因调控中的重要性[11]。

4.3 自噬作用

自噬现象普遍存在于大部分真核细胞中，主要介导了损伤的蛋白质和细胞器的特异性降解，而自噬激活通常被认为是细胞存活的适应性和保护机制[32]。关于CM上培养对MSCs自噬方面的研究较少。

在既往研究中，提出CM诱导形成的MSCs球状体中自噬增强的观点。实验中观察到CM培养方法增强了MSCs的自噬反应，且自噬水平与球体形成的效率相关联，Ca2+可能在CM底物衍生的MSCs球体的自噬诱导中发挥了积极作用。而MSCs球状体中的增强的自噬不仅可以保护细胞形成应激，还可以防止细胞在体外扩增期间的早期衰老，从而使MSCs移植后具有更好的生存和治疗效果[33]。而近期的一项研究提出了新的观点，认为CM底物上MSCs球体中心的原始MSCs发生自噬活化，而附着于球体外周的晚期衰老细胞，发生自噬失活，进而被诱导凋亡，因此推测CM成球培养方式通过抑制自噬特异性诱导晚期衰老细胞凋亡以增强MSCs的干细胞特性[34]。

5 CM培养MSCs的临床应用前景

5.1 组织修复领域的治疗潜力

与传统的MSCs注射疗法相比，通过各种方式诱导形成的MSCs球体展现出了更好的治疗效果，而通过CM诱导形成的MSCs 球体具有以下治疗优势：CM诱导形成的MSCs球体具有更强的多向分化潜能和迁移趋化能力，移植后可更高效的定向分化，修复受损组织；“球体效应”营造的低氧等环境使MSCs的适应能力加强，并加强了抗炎抗肿瘤等活性因子的释放；CM培养方法较其他成球培养方式技术要求简单，易于大规模推广。基于以上优势，若在移植前通过CM培养对MSCs进行预处理，可有效增强MSCs的生物活性，更好地发挥其修复组织的效果。

5.2 分选原始MSCs的应用潜力

MSCs是异质性细胞群体，连续的传代培养可能造成其不同程度的衰老，而维持干细胞特性对MSCs的治疗作用至关重要。CM上MSCs细胞球体干性基因表达水平的上调可能归因于从异质群体中分选出了更为原始的MSCs。

此前有研究发现，异质性牙龈纤维细胞在CM培养后形成的细胞球体较其他细胞具有更高的干性基因的表达水平，实质上从异质的细胞集团中筛选到更具干性的更具多向分化潜能的MSCs亚群，推测其与钙黏蛋白的高表达有关[35]。近期的研究结果认为，CM培养MSCs特异性地激活衰老细胞中mTORC1途径以灭活自噬，诱导其凋亡，从而选择更具分化潜能的MSCs。CM培养过程中，MSCs起初3 d发生了显著的细胞凋亡，MSCs球体中外围细胞出现死亡，并且与早期传代相比，晚期传代的细胞球体外围出现更高的凋亡细胞比例，表明其诱导凋亡对衰老细胞具有特异性[35]。这可能解释了CM培养MSCs球体具有更高的干性基因表达水平的原因，一定程度展现出CM培养在分选高效MSCs用于再生医学的可行性。

6 小结

综上所述，CM培养方式诱导形成的MSCs球体较传统贴壁培养的MSCs在干性维持、旁分泌效应及迁移趋化等生物活性方面均有显著提升，这为临床上提高MSCs细胞疗法的效果提供了新思路。目前，关于CM成球培养增强MSCs生物活性的机制以及相关信号通路有一定了解，但还有大量问题需要进一步深入研究。比如，CM培养模式下诱导MSCs 聚集成球及生活学功能改变的具体机制；探讨CM成球培养分选原始MSCs的可行性；CM培养方式下如何获得大量均匀、适当粒径的MSCs球体，既达到促进细胞生物活性而不至于导致中央区细胞缺氧坏死。揭开这些问题有助于进一步了解CM诱导MSCs球体的理化性质，建立更加稳定的CM成球培养体系，从而推动MSCs的临床应用。